荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值比较

刘 青

黄河中心医院检验科，河南郑州 450003

乙型病毒性肝炎是世界常见的感染性疾病之一，全球约有3.5亿慢性感染患者[1]，我国乙型肝炎病毒感染患者约有1.2亿，每年死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及肝癌的患者约有100万[2]。根据HBV-DNA全基因组序列差异≥8%或S基因序列差异≥4%，临床上一般将HBV分为A～H型，共计8个基因型[3]，我国主要分布的是B型、C型以及B、C混合型。对HBV感染患者进行正确分型，是指导下一步诊断治疗的重要依据。目前，临床上常用的有荧光定量分型PCR法与直接测序法。为比较荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值。该研究2012年1月—2013年12月间拟通过对该院收治的126例HBV患者分别采用荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平，以比较两种方法的应用价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院收治的126例符合入选标准的HBV患者，其中男性 74 例，女性 52 例；年龄为 21～64 岁，平均（48.13±10.72）岁；病程为 6 个月～6 年，平均（2.67±0.47）岁。

1.2 纳入与排除标准

①符合中华医学会关于乙型病毒性肝炎的诊断标准[4]；②HBsAg阳性；③排除心、肺、肾等功能严重障碍患者；④排除妊娠及哺乳期女性患者；⑤排除合并其他可对实验结果造成影响的疾病患者；⑥自愿参加并签署知情同意书。

1.3 主要仪器和试剂

主要仪器包括CFX96实时定量PCR仪 （美国Bio-Rad公司），ABI3100基因分析仪（美国ABI公司）。主要试剂包括Premix Taq PCR扩增试剂盒及DNA Marker（TaKaRa公司）。

1.4 检测方法

采集HBV患者空腹静脉血，离心，利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒从血清中提取HBV-DNA，溶于DEPC处理水，-20℃保存。

1.4.1 荧光定量分型PCRPCR反应总体积20μL，包括PCR反应混合液10μL，DNA模板 2μL，0.3μmol/LB型探针 2μL，0.3μmol/L C型探针 2μL，0.5μmol/LB、C型引物 2μL。CFX96实时定量PCR仪进行扩增，CFXManagerTM1.1软件行数据分析处理。

1.4.2 直接测序法 选用引物对基因S区进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性处理5min，55℃处理30s，72℃处理30s。双脱氧链末端终止法扩增测序片段并纯化，ABI3100基因分析仪进行序列分析。采用NCBI工具行基因分型。

1.4.3 TA克隆 若样本经两种方法检测结果不一致，则行TA克隆，挑选20～40个阳性克隆，对单菌落测序进行基因型检测。

1.5 统计方法

采用SPSS18.0统计学软件进行数据的分析和处理。率的比较采用χ2检验，两种检测方法基因分型结果进行一致性检验。

2 结果

2.1 基因分型

126份样本经两种方法检测均成功分型，只检测出3种基因分型（B型、C型、B/C混合型），其中B型占明显优势。荧光定量分型PCR法B/C混合型检出率明显高于直接测序法，差异有统计学意义（P＜0.001），见表1。

表1 两种检测方法HBV-DNA基因分型结果比较[n（%）]

2.2 结果一致性检验

对两种检测方法的HBV-DNA基因分型结果进行一致性检验，Kappa＞0.75，表明两种检测方法的一致性较好，见表2。

表2 两种检测方法HBV-DNA基因分型结果一致性检验（n）

2.3 TA克隆

共计23份样本经两种方法检测的HBV-DNA基因分型结果不一致，从中随机抽选8份样品（荧光定量分型PCR法检测结果为B/C混合型，直接测序法检测结果为单一基因分型）进行TA克隆，分别选出30个克隆之后进行测序的基因型，结果示8分样品均存在B/C混合感染，该结果与荧光定量分型PCR法一致。

3 讨论

乙型肝炎病毒是双链DNA病毒，可导致急、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌，其基因序列高度变异，这是因为HBV的逆转录酶缺乏校正活性，复制过程中可产生大量的核苷酸错配，HBV的变异率比其他DNA病毒高10倍以上[5]。我国大陆地区主要以B和C基因型为主，南方以B基因型为主，北方则以C基因型为主，有研究表明我国宁夏地区、广东地区及香港地区约有15%的乙肝病毒感染者基因型为D型[6]。也有研究表明肝癌患者中的C基因型比例明显高于慢性乙型肝炎患者中的C基因型比例[7]，而在乙型肝炎病毒携带者中未检测到C基因型，因此对乙型肝炎病毒进行基因分型，对乙型肝炎患者的治疗及预后判断具有重要意义。随着分子生物学检测技术的发展，出现了多种乙型肝炎病毒耐药变异及基因分型的检测方法，主要包括直接测序法、PCR分型法、聚合酶反应法、杂交法及酶联免疫法[8]。DNA直接测序法，被公认为HBV基因耐药变异检测的金标准，既可以得到已知变异点的信息，还可以提示可能的未知的耐药变异位点，但缺点是灵敏性差，当变异株超过HBV准种池的20%时才能被发现。荧光定量分型PCR法是一种新兴的应用于临床的方法，目前主要包括两种方法，即溶解曲线法和特异性探针法。荧光定量分型PCR法特异性和敏感性均较好，操作相对较简便，降低了检测过程中受污染的可能性，逐渐在临床上推广应用。该研究通过对126例HBV患者分别采用荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平，发现荧光定量分型PCR法B/C混合型检出率（25.40%）明显高于直接测序法（7.14%），经统计学分析表明，差异有统计学意义（P＜0.001）；TA克隆结果与荧光定量分型PCR法一致。该结果表明，荧光定量分型PCR法检测结果准确可靠，与直接测序法相比，对于混合型HBV-DNA检出率明显占优势，敏感性较高。综上所述，荧光定量分型PCR法检测HBVDNA水平应用价值较直接测序法高，值得临床推广应用。

[1]Domingo E.Quasispecies and the development of new antiviral strategies[J].Prog Drug Res,2003,60:133-158.

[2]梁晓峰,陈园生,王晓军,等.中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究[J].中华流行病学杂志,2005（26）:655-658.

[3]陈占国,周武,王忠永,等.实时荧光定量PCR检测血HBV-DNA的疑难结果分析及其对策[J].中华检验医学杂志,2013,36(3):217-221.

[4]中华医学会传染病与寄生虫病学会,肝病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志,2001,19(1):56-62.

[5]Liu CJ,Jeng YM,Chen CL,et al.Hepatitis B virus basal core promoter mutation and DNA load correlate with expression of hepatitis B core antigen in patients with chronic hepatitis B[J].J Infect Dis,2009,199(5):742-749.

[6]阎丽,候金林,郭亚冰,等.乙型肝炎病毒基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立[J].中华传染病杂志,2001,19(4):224-227.

[7]王永忠,周国平,李夏亭,等.乙型肝炎病毒基因分型及临床应用研究[J].中华实验和临床病毒学杂志,2002,16(4):367-369.

[8]Mota A,Guedes F,Areias J,et al.Epidemiological and genetype profile of hepatitis B virus infection in Northern Portugal[J].Rev Sande Publian,2010,44(6):1087-1093.