林雨芳
[摘要] 目的 观察血管性痴呆大鼠经电针刺激后海穴后海马区IGF-1蛋白表达的影响。 方法 2013年5月—2014年10月期间，在福建中医药大学实验室，选取50只SD大鼠，随机分为5组，每组10只，分别为：空白组，假手术组，模型组，电针治疗组，非穴治疗组，采取双侧颈总动脉永久性结扎（2-VO）法复制血管性痴呆大鼠模型。经过Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力的方法，免疫组化测定大鼠海马区IGF-1蛋白的检测方法观察五组大鼠在Morris水迷宫中的平均逃避潜伏期、海马区IGF-1蛋白的表达情况。 结果 模型组大鼠的平均逃避时间（75±5.12）s，比假手术组大鼠（28±3.45）s长；海马区IGF-1蛋白表达上，模型组大鼠（40.3±6.1）分比假手术组大鼠（53.4±3.2）分降低，差异有统计学意义（P<0.05），电针治疗组（39±6.21）s比模型组大鼠（75±5.12）s的平均逃避时间短，海马区IGF-1蛋白表达，电针治疗组（49.7±3.8）分比模型组大鼠（40.3±6.1）分增高，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 电针VD大鼠督脉上后海穴可以改善VD大鼠的学习记忆能力，其机制可能是与改善海马区IGF-1蛋白表达有关。
[关键词] IGF-1蛋白；电针；血管性痴呆
[中图分类号] R25 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）03（c）-0030-04
Effect of Sea Cave after the Electroacupuncture on the Expression of IGF-1 Protein in Hippocampal Region of the Vascular Dementia Rats
LIN Yu-fang
Department of Acupuncture and Moxibustion， Fuzhou First Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350009 China
[Abstract] Objective To observe the effect of sea cave after the electroacupuncture on the expression of IGF-1 protein in hippocampal region of the vascular dementia rats. Methods 50 cases of SD rats in the laboratory from May 2013 to October 2014 were selected and randomly divided into 5 groups with 10 cases in each， respectively the blank group， sham-operation group， model group， electoracupuncture treatment group， and non-acupoint treatment group， and the models of vascular dementia rats was duplicated by the 2-VO method， and the ability to learn the memory of rats was tested by the Morris water maze， and the test method of IGF-1 protein of rats in the hippocampal region was measured by the immunohistochemical method to observe the average escape latency and expression of IGF-1 protein in the hippocampal region. Results The average escape time of rats in the model group was longer than that in the sham-operation group[（75±5.12）s vs （28±3.45）s]， and the expression of IGF-1 protein in the hippocampal region in the model group decreased compared with that in the sham-operation group[（40.3±6.1）points vs （53.4±3.2）points]， and the difference was statistically significant（P<0.05）， and the average escape time in the electroacupuncture treatment group was shorter than that in the model group[（39±6.21）s vs （75±5.12）s]， and the expression of IGF-1 protein in the hippocampal region increased compared with that in the model group[（49.7±3.8）points vs （40.3±6.1）points]， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The houhai acupointel in the governor meridian of rats by the ectroacupuncture VD can improve the ability to learn memories of VD rats， and the mechanism may be related to the improvement of expression of IGF-1 protein in hippocampal region.
[Key words] IGF-1 protein； Electroacupuncture； Vascular dementia
血管性痴呆（VD）是因为多次的脑卒中等脑血管病症而导致的一种疾病。由于脑部缺血缺氧，脑组织不能得到所需营养物质，逐渐影响脑部各类相关蛋白，导致蛋白表达产生变化，不在正常水平范围内，从而影响了认知学习能力，产生学习记忆能力的障碍。为老年期一慢性进行性疾病之一。随着老龄化人口的到来，血管性痴呆在老年人口中所占比例越来越高，在我国，血管性痴呆占人口比例高达60%。虽然国内外涌现出许多对VD的治疗现状及治疗方法的研究，但是目前尚无非常满意的治疗方法。基于此，该研究应用电针针刺血管性痴呆大鼠的督脉后海穴，观察针刺后VD大鼠海马区IGF-1蛋白的变化，以期发现电针治疗血管性痴呆大鼠的治疗机制。基于此，该研究从2013年5月—2014年10月，应用电针针刺50例血管性痴呆大鼠的督脉后海穴，观察针刺后VD大鼠海马区IGF-1蛋白的变化，以期发现电针治疗血管性痴呆大鼠的治疗机制。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
雄性SD大鼠65只，体重为（610±60）g，SD大鼠年龄约11个月龄。运用Morris水迷宫实验筛选出认知记忆功能比其它较好的SD大鼠一共50只，并且记录好每只SD大鼠的逃避潜伏期的平均值（单位：s）。将50只大鼠按随机数字表法分为5组，各组定义为空白组（A），假手术对照组（B），模型组（C）、电针治疗组（D）、非穴治疗组（E），每组10只，每组大鼠体重均为（610±60）g，大鼠年龄11个月月龄。
1.2 造模：血管性痴呆大鼠
血管性痴呆大鼠的造模采用的是2-VO法。术前禁食12 h，禁水4 h，用10%的水合氯醛（ 3 mL/kg）麻醉。空白组（A）不处理，假手术组（B）的处理方法跟2-VO法相类似，但是双侧颈总动脉未采取结扎。每组大鼠的饲养条件是一样的。
1.3 判断血管性痴呆大鼠模型复制成功与否
经过造模后6周，5组大鼠均进行Morris水迷宫测试，在测试中记录每只大鼠的逃避潜伏期，并得出潜伏期均值（单位：s）。
1.4 治疗
1.4.1 穴位选择 后海穴选穴参照《实验针灸学》中定位方法取穴：位于大鼠的尾根部与肛门之间的凹陷处。
1.4.2 治疗方法 电针治疗组：造模成功后选用“后海穴”（相当于人体的长强穴）进行针刺治疗。穴位取法参照《实验针灸学》中大鼠的穴位定位方法取穴[1]。后海穴：位于大鼠肛门和动物尾根部之间的凹陷处。以30号0.5寸毫针，直刺“后海”穴0.2～0.3寸，针刺后连接韩式电针仪器，中等刺激强度，试验中必须要确保接受针刺治疗的大鼠不燥动。在相同时间段里，每天每只大鼠电针连续刺激 20 min，不间断的治疗10 d作为1个疗程，2个疗程之间需要间隔3 d，共计治疗3个疗程。
空白对照组、假手术对照组不使用电针刺治疗，饲养条件一样。
1.5 指标检测
1.5.1 Morris水迷宫行为学观察 采用标准的Morris水迷宫进行测试，在测试实验期间，参与实验的人员、水迷宫平台的放置位置，相关的实验室环境以及水迷宫池子周边的物体应保持不变。
在水迷宫测试实验中，分为两部分内容：①固定位置航行实验，本实验用于测试大鼠的空间学习能力。该实验历时7 d，每天上午10∶00开始，实验操作者手持大鼠，将其头部冲着水迷宫的池壁，然后让大鼠从水迷宫的4个不同象限进入水中，1 d测试4次，然后记录每只大鼠逃避潜伏期，即每只大鼠能够找到水迷宫中的平台的时间。如果大鼠在120 s时间内一直找不到水迷宫中的平台，操作者帮助此大鼠找到平台，然后让其在平台上站立10 s，之后再让其下来休息60 s后，再依次从另一象限开始继续实验。②大鼠的空间记忆能力检测，又称为空间探索实验：在第7天的最后一次即第4次水迷宫测试实验结束后，将水迷宫中设置的平台撤离，然后让大鼠继续进入水迷宫中，观察其在原先平台所在的象限所停留的时间，总观察时间为120 s。
1.5.2 免疫组化 实验大鼠的各项治疗与测试结束后，随机抽取各组大鼠6只，根据大鼠的体重，精确计算每只大鼠所需的10%的水合氯醛溶液剂量，然后用注射器抽取后，在大鼠腹腔注射后，使大鼠处于深度麻醉后，顺序剥离大鼠的皮肤，肌肉，取出大鼠的脑组织，并进行脱水，石蜡包埋，切片等处理。石蜡切片采用标准的SP法，DAB显色后，可以检测到所抽取大鼠脑组织中的IGF-1蛋白的表达情况。
1.6 统计方法
实验所测得数据用 SPSS 18.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，正态分布偏态分布计量资料的比较采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Morris 水迷宫观察结果
由表1可知，模型组大鼠在定位航行实验中，平均逃避潜伏时间比空白组和假手术组长（P<0.05）；电针治疗组的平均逃避潜伏时间比模型组短（P<0.05），非穴治疗组与模型组对比差异无统计学意义。
2.2 大鼠海马区IGF-1蛋白的观察结果。
由表2可知，经过免疫组化干预后，模型组大鼠海马区的IGF-1蛋白表达比空白组和假手术组低（P<0.05）；电针治疗组的IGF-1蛋白表达比模型组高（P<0.05），非穴治疗组与模型组对比，差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
血管性痴呆（VD）是因多次的脑卒中等脑血管病症而导致的一种疾病[1-3]。由于脑部缺血缺氧，脑组织不能得到所需营养物质，逐渐影响脑部各类相关蛋白，导致蛋白表达产生变化，不在正常水平范围内，从而影响了认知学习能力，产生学习记忆能力的障碍。在该实验中，应用双侧颈总动脉结扎（2-VO）法制备了血管性痴呆大鼠的模型，既采用此原理。由于缺血缺氧，模型组大鼠在水迷宫实验中，其平均逃避时间（75±5.12）s比假手术组大鼠（28±3.45）s延长，学习记忆能力降低。
治疗血管性痴呆的关键在于改善脑部的缺血缺氧状态，进而影响脑部相关蛋白的正常表达，在此基础上，才能改善血管性痴呆患者的认知学习能力。《针灸聚英》云，长强一名气之阴郗，一名橛骨，脊骶骨端下三分，伏地取之乃得。《铜人》：针三分，针转以大痛为度，灸不及针，日灸三十灸，止二百壮。课题组相关研究发现，针刺督脉上的长强穴能够明显改善学习认知能力[4]。该实验中，针刺血管性痴呆大鼠督脉上的后海穴，即长强穴，可以改善脑部缺血缺氧导致的学习记忆能力。经过3个疗程的针刺后海穴治疗后，针刺组大鼠在水迷宫实验中，平均逃避潜伏时间（39±6.21）s比模型组大鼠（75 ±5.12）s明显缩短差异有统计学意义（P<0.05）。
血管性痴呆主要表现为精神神经功能障碍和出现神经系统的症状。治则以补肾填精、健脑益智为主。本病病位在脑，“脑为髓之海”。督脉者，起于长强，入络脑。针刺督脉上的后海穴（即长强穴），能补肾填精，健脑益智，改善血管性痴呆的认知学习能力。
胰岛素样生长因子IGF-1与VD的发病关系密切。IGF-1蛋白可以通过多种方式保护因脑卒中而导致的脑神经细胞缺血缺氧的神经细胞，实现其对缺损神经功能的恢复[5-6]。IGF-1蛋白是大脑海马区的重要蛋白，是认知等神经功能得以实现的相关蛋白之一。在该研究中，经过电针刺激血管性痴呆大鼠的督脉后海穴，经过3个疗程的治疗后，VD大鼠海马区的IGF-1蛋白表达（49.7±3.8）分比模型组（40.3±6.1）分增高，其变化促使电针治疗后的VD大鼠在水迷宫测试实验中，认知学习能力得到改善[7]。Zhao等[8]的研究表明，野生型的小鼠喂予含西洛他唑的食物4周后，可以提高海马组织中IGF-1和IGF-1mRNA的水平，并可明显增强水迷宫测试中的学习记忆能力，由此推断西洛他唑可能是通过促进海马IGF-1的合成而改善认知功能的。
IGF-1蛋白不但可以修复在脑缺血性损伤中的神经元，降低其因缺血缺氧而导致的神经元受损程度，还能够促进神经元修复过程中其他类的神经营养因子对脑神经细胞的修复作用[9]。Traub等[10]在大鼠四血管结扎术而致全脑缺血的模型前2周及造模后2周均给予IGF-1，结果发现与对照组相比，IGF-1给药组海马CA1区神经元细胞的死亡数目显着减少。程红亮等[11]研究发现，在进行治疗前，针刺组与药物组的血管性痴呆患者的IGF-1水平变化无明显差异。治疗后针刺组IGF-1水平（78.36±12.41）分明显升高，与药物组（69.39±12.14）分比较，差异有统计学意义（P<0.05）。在该课题中，血管性痴呆大鼠经过电针刺激督脉上的后海穴，可以显着增强其大脑海马区IGF-1蛋白的表达（49.7±3.8）分，降低了海马区椎体细胞的丢失，从而改善了血管性痴呆大鼠的认知学习能力。电针后海穴组大鼠的平均逃避时间比模型组大鼠短，海马区的IGF-1蛋白表达增强。
综上所述，电针长强穴可以有效的改善血管性痴呆大鼠的认知行为能力。在接下来的实验研究中，该研究将加大实验例数，增加实验指标，进一步论证电针治疗对血管性痴呆的治疗机制，以期希望能够在临床中为血管性痴呆患者的治疗提供有效帮助，改善血管性痴呆患者的生活质量。
[参考文献]
[1] 史哲.36 例血管性痴呆的针刺治疗[J].辽宁中医药大学学报，2016，17（2）：90-92.
[2] Westwood AJ，Beiser A，Decarli C，et al. Insulin-like grow th factor-1 and risk of Alzheimer dementia and brain atrophy[J].Neurology，2014，82（18）：1613-1619.
[3] Ungvari Z，Csiszar A. The emerging role of IGF-1 deficiency in cardiovascular aging： recent advances[J].J Gerontol A Biol SciMed Sci，2012，67（6）：599-610.
[4] 张学君，刘静.针刺后海穴对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马CA1区突触素蛋白表达和超微结构的影响[J].天津中医药大学学报，2013，32（2）：87-91.
[5] 吴叶娟，步仰高，王杨，等.IGF-1 对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠脑细胞线粒体膜电位的影响[J].安徽医科大学学报，2013，48（9）：1001-1005.
[6] Bella R，Cantone M，Lanza G，et al.Cholinergic circuitry functioning in patients with vascular cognitive impairment-no dementia[J].Brain stimulation，2016，9（2）：225-233.
[7] Corriveau RA，Bosetti F，Emr M，et al. The science of vascular con-tributions to cognitive impairment and dementia （VCID）：a frame-work for advancing research priorities in the cerebrovascular biologyof cognitive decline[J].Cellular and molecular neurobiology，2016，36（2）：281-288.
[8] Zhao J， Harada N， Kurihara H， et al.Cilostazol improves cognitive function inmice by increasing the productiono finsulin-like growth factor-I in the hippocampus[J].Neuropharmacology，2010，58：774-783.
[9] 韦登明，贾学敏，尹向旭，等.电针改善血管性痴呆大鼠学习记忆及其与海马神经细胞蛋白激酶C表达的关系[J].中国老年学杂志，2013，33（2）：328-330.
[10] Traub ML，De Butte-Smith MZ，Zukin RS，et al.Oestradiol and insu-lin-like growth factor-1 reduce cell loss after global is chaemiainmid-dle-aged female rats[J].J Neuroend ocrinol，2009，21：1038-1044.
[11] 程红亮，胡陪佳. 通督调神针刺法对血管性认知障碍患者血清IGF-1表达的影响[J].世界中医药杂志，2015，10（10）：1586-1589.
（收稿日期：2017-12-25）
