周玮婧，李书艺，孙智达*，谢笔钧
(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)
不同品种荔枝皮花色苷提取物粒径与色度对其抗氧化活性的影响
周玮婧，李书艺，孙智达*，谢笔钧
(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)
比较9种荔枝皮花色苷在不同体积分数乙醇中粒径的分布，以及不同品种的色度差异，并将花色苷粒径和色度指标与其抗氧化活性之间进行相关性分析。结果表明，糯米糍在35%乙醇溶液中粒径分布最好，为2.48～6.51μm，D50为4.56μm，比表面积为498.23m2/kg，且不同品种荔枝皮花色苷粉末在乙醇溶液中分布变化明显。糯米糍具有最大彩色度c*值(110.27)和a*值(87.12)，妃子笑具有最大L*值(94.86)和b*值(98.79)；不同品种的色度变化在红色与黄色之间。花色苷含量、抗氧化活性(清除率、IC50)与粒径指标(D50、比表面积)和色度指标(L*、a*、b*、c*、h)具有相关性，且荔枝皮花色苷颗粒对色度也有着决定性影响。
荔枝皮花色苷；粒径；抗氧化活性；Lab色度系统；相关性分析
荔枝(Litchi chinensis Sonn.)为无患子科(Sapindaceae)常绿乔木，我国主要产于广东、福建、广西等地。其中荔枝皮质量占果实总质量的16%左右，富含黄烷醇类和水溶性多糖等生理活性物质，具有较高的经济和药用价值[1]。粒径及其分布是表征乳液、悬浮液和粉末等颗粒体系的重要指标，对产品性能和使用均有影响[2]。同时采用激光粒度仪系统分析，优点突出，测量速度快，测量过程自动化程度高，准确可靠，适用面极广[3]。CIE-Lab系统又称CIE 1976均匀颜色空间。其颜色空间的色坐标由L、a、b表示，现在己成为世界各国正式采纳、作为国际通用的测色标准。它适用于一切光源色或物体色的表示与计算[4]。根据文献报道，葡萄籽原花青素提取物的标准中对粒径和色度的要求为过100目，呈红棕色的粉末，却并没有详细的数据标准[5]。本实验以荔枝皮花色苷提取物为研究对象，对广东省9个具有代表性的品种的荔枝皮花色苷在不同乙醇体积分数中的粒径大小、粒径分布和色度等物理特性进行测试，探讨荔枝皮花色苷在不同体积分数乙醇中的粒径分布特征，比较不同品种荔枝皮花色苷色度的差异，最后讨论这些性质与荔枝皮花色苷抗氧化活性之间的相关性，旨在为荔枝果皮天然产物开发与工业化生产标准提供一定的数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荔枝为：白腊(Litchi Chinensis Sonn. cv. Baila)、妃子笑(Litchi Chinensis Sonn. cv. Feizixiao)、玉荷包(Litchi Chinensis Sonn. cv. Yuhebao)、黑叶(Litchi Chinensis Sonn. cv. Heiye)、丁香(Litchi Chinensis Sonn.cv. Dingxiang)、糯米糍(Litchi Chinensis Sonn. cv.Nuomici)、青壳(Litchi Chinensis Sonn. cv. Qingke)、桂味(Litchi Chinensis Sonn. cv. Guiwei)、怀枝(Litchi Chinensis Sonn. cv. Huaizhi)等9个品种，由广东省农科院生物研究所提供，选择色泽鲜艳，果形匀称，未受机械损伤的荔枝，迅速去壳，并将果皮装入保鲜袋中，封口，置于－18℃下保存备用。
AB-8大孔吸附树脂 南开大学化工厂；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SH2-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；BT-9300H激光粒度仪 丹东市百特仪器有限公司；DCP3型全自动测色色差计 北京兴光测色仪器公司；S-54可见-紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司；JA2003电子天平 上海天平仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 荔枝皮花色苷提取物的制备
取一定量预先准备的荔枝果皮，用60%的乙醇溶液按照1:20(m/V)的固液比混合均匀，50℃恒温水浴锅中提取90min，收集滤液进行真空抽滤，得到样品粗提液。滤液过树脂吸附柱AB-8，用水洗下不被吸附的杂质，用80%的乙醇冲洗树脂吸附柱，收集乙醇洗脱液后减压蒸馏得到浓缩液，经冷冻干燥后，得到荔枝皮花色苷的样品粉末。
1.3.2 荔枝皮提取物的粒径测定
采用BT-9300H激光粒度仪测定样品粉末在不同体积分数的乙醇溶液中的粒度分布情况。将不同品种的样品粉末分别溶于体积分数为35%、70%和95%的乙醇溶液中，在超声波分散器内分散均匀(约12min)，配制成样品溶液。取适量溶液置于样品池中，观察粒度分布图谱。为保证测试结果的重现性和可靠性，以多次测定的平均值为最后结果[6]。
1.3.3 荔枝皮提取物色度指标分析
将样品粉末溶于35%的乙醇溶液中，配制成5mg/mL的样品溶液。使用DC-P3全自动测色色差计，测定9种荔枝皮提取物的L*、a*、b*值，并根据公式(1)、(2)计算其彩色度(c*)和色调角(h)，每种样品溶液测定3次，取平均值[7]。
1.3.4 荔枝皮花色苷含量的测定
花色苷含量的测定采用pH示差法[8]，测定3次取其平均值。
1.3.5 荔枝皮花色苷抗氧化活性测定
采用水杨酸羟基化法[9]测定不同品种荔枝皮花色苷的抗氧化活性，3mL反应液中含0.15mmol/L FeSO4、6mmol/L H2O2、2mmol/L水杨酸钠及不同品种的荔枝皮花色苷提取液，加入H2O2引发反应，37℃保温1h后，加0.12mL 11.0mol/L HCl终止反应，测定510nm波长处的吸光度，计算其清除率，重复操作3次，求其平均值。并计算出自由基清除率为50%时的自由基清除剂的浓度，即IC50。
式中：Ao为对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度。
2 结果与分析
2.1 荔枝皮花色苷的粒径分析
激光粒度仪是以米(Mie)散射理论为依据，通过探测微粒的米氏散射能量和相应的散射角度，计算出粒径分布[10]。以9个广州特有荔枝品种的果皮为代表，比较其花色苷在35%、70%和95%不同乙醇体积分数下的粒径及粒径分布情况。如表1所示，在每个品种中，不同粒径的分布频率在乙醇体积分数变化时也明显不同，溶解在高体积分数乙醇中时，较大粒径(＞100μm)的荔枝皮花色苷所占的比例明显大于较小粒径(＜10μm)所占的比例。以糯米糍为例，在乙醇体积分数为35%时，中粒径(D50)仅为4.56μm，粒径分布在 2.48～6.51μm之间，而当乙醇体积分数增加到95%时，其粒径随着乙醇体积分数的升高而增大，D50为179.8μm，大于低体积分数乙醇时的提取物中粒径，且粒径分布为23.51～307.00μm，范围扩大，峰型变宽。比表面积的变化也与其相似，在乙醇体积分数为35%时的比表面积498.23m2/kg，而当乙醇体积分数逐渐增大时，荔枝皮花色苷的比表面积减小。在乙醇体积分数为35%时，丁香和青壳的粒径较大，分别为117.57μm和117.07μm；比表面积较小，为43.17m2/kg和19.27m2/kg，其余品种的粒径差异不大。总体上看，随着乙醇体积分数的增加，荔枝皮花色苷的平均粒径增加，说明颗粒已发生了一定程度的聚集，形成了大的颗粒。由于粒径越小，颗粒分布均匀，稳定性更好，所以糯米糍品种荔枝皮花色苷粉末在35%乙醇时的分布最好。因此，选择35%乙醇作为荔枝皮花色苷的溶剂。
表1 不同品种荔枝皮提取物在不同体积分数乙醇溶液中粒径的分布情况Table 1 Particle size distribution parameters of anthocyanin extracts prepared from different varieties of litchi pericarp in different concentrations of aqueous ethanol solutions
在乙醇为35%的最佳分布体积分数下，比较9种荔枝皮花色苷粉末的粒径和粒径分布情况，如图1所示，其中丁香和青壳在大于100μm时出现峰型，中粒径分别为117.57μm和117.07μm，黑叶也有32.22%粒径超过100μm；糯米糍的平均粒径最小，分布在小于10μm内；其余品种的粒径差异不大，在12.43～56.38μm之间，比表面积在88.78～309.23m2/kg之间；则粒径组成的区间均集中在10～100μm内。结果表明9种荔枝皮提取物粉末的粒径分布在2.0～22μm，D50＜22μm的粒径累计不少于95%。
图1 不同品种荔枝皮花色苷在35%乙醇溶液中粒径的分布图Fig.1 Particle size distribution of anthocyanin extracts prepared from different varieties of litchi pericarp in 35% aqueous ethanol solution
2.2 荔枝皮花色苷的色度指标和含量分析
表2 不同品种荔枝皮的花色苷含量以及色度指标Table 2 Anthocyanin contents and color parameters in 35%aqueous ethanol solution of anthocyanin extracts prepared from different varieties of litchi pericarp
如表2所示，通过对荔枝皮花色苷的含量测定，糯米糍和怀枝品种的荔枝皮花色苷质量分数均超过了10‰，分别达到了18.89‰和10.66‰，其余品种花色苷含量在1.67‰～7.68‰之间。用L*、a*、b*值表示荔枝皮花色苷粉末的色度，c*表示色饱和度；h表示色角[11]。在CIELab表色系统中，妃子笑提取物具有最大的明亮度L*值为94.86；在a*值中，丁香最小为24.35，红色偏浅，糯米糍最大为87.12，红色偏深；而妃子笑b*值为98.79，呈黄色，青壳b*值为仅为4.08；糯米糍具有最大的色饱和度c*为110.27，丁香的c*值仅有25.08。一个重要原因可能是因其果皮叶绿素含量过高，妨碍了花色苷红色的表现，而糯米糍果皮叶绿素的降解为红色的显现提供了有利条件[12]。9种荔枝皮提取物的色角从24.83°(妃子笑)到 81.11°(青壳)，即均在红色和黄色的范围内变化。
表3 荔枝皮花色苷色度、粒径指标与抗氧化活性相关性分析Table 3 Correlation among anthocyanin content, maximum hydroxyl free radical scavenging rate or IC50 and particle size distribution parameters and color parameters in 35% aqueous ethanol solution
图2 不同品种荔枝皮花色苷清除·OH的能力Fig.2 Maximum hydroxyl free radical scavenging rate and IC50 of anthocyanin extracts prepared from different varieties of litchi pericarp
2.3 荔枝皮花色苷清除羟自由基效果分析
按照1.3.5节的方法，测得荔枝皮花色苷溶液清除羟自由基的效果，利用Fenton[13-14]反应产生·OH(H2O2+Fe2+→·OH+OH－+Fe3+)，随着反应体系中花色苷含量增大，清除·OH的能力随之提高。由图2可知，荔枝皮花色苷提取液都有着较强的清除·OH的能力，当9个品种质量浓度达到1.5mg/mL时，怀枝的清除率最高为83.43%，除丁香的清除率较低以外，其余品种的清除率均超过60%。而糯米糍的IC50值最低0.23mg/mL，其余品种的IC50值均在0.26～0.91mg/mL之间。
2.4 荔枝皮花色苷抗氧化活性与各指标相关性分析
通过SPSS软件分析荔枝皮花色苷含量与抗氧化活性指标(清除率、IC50)、粒径指标(D50、比表面积)以及色度指标(L*、a*、b*、c*、h)之间的相关性。如表3所示，花色苷含量与其色度指标中a*值、彩色度c*和粒径指标中的比表面积线性正相关(P＜0.01，r＝0.881；P＜0.01，r=0.776；P＜0.05，r=0.850)，而与平均粒径D50线性负相关(P＜0.01；r=－0.673)。且荔枝皮花色苷抗氧化活性中，清除率指标与色度中a*值与c*值成线性相关(P＜0.05；r=0.771，r=0.734)，而IC50值与色度的各指标相关性均为极显着(P＜0.01，r=－0.775～－0.949)，与h相关性显着(P＜0.05，r=0.704)，与粒径指标中D50也成极显着的相关性(P＜0.01；r=0.842)。另一方面，在粒径与色度指标之间的相关性分析中，平
均粒径D50与色度指标a*值、b*值和彩度c*均有负相关性，r值分别为－0.803、－0.669和－0.830；比表面积与a*值同样具有显着相关性(P＜0.05，r=0.714)。不同颜料分子的组成和结构，决定了颜料对可见光某种波长的选择性吸收，从而反射和散射出特定波长的光，表现出了特征颜色，这是产生颜色的必要条件。颜料颗粒的形状、大小及分布则决定了反射和散射光的质和量，是产生颜色的充分条件[15]。荔枝皮花色苷含量决定了其在乙醇中溶解后的颜色性质与粒径分布，且荔枝皮花色苷颗粒的分子组成、结构、聚集体的大小、性状及分布也对花色苷颜色有决定性的影响。花色苷在乙醇中的粒径越小，颗粒分布越窄，花色苷的色彩饱和度越高，颜色越鲜艳。同时也可以看出，由于花色苷分子容易溶解于亲水体系中，所以在水体系中的清除·OH的活性测定中，如果粒径越大，花色苷因分子间的聚集使之羟基被包埋，抗氧化效果越差，反之则越好。
3 结 论
3.1 荔枝皮花色苷粉末的分布特征为：随着乙醇体积分数的增大，粒径逐渐增大，且粒径分布变广。其中在乙醇体积分数为35%时糯米糍花色苷粒径最小，颗粒分布最均匀，稳定性最好。
3.2 运用CIELab表色系统，对荔枝皮花色苷的色差指标进行测量，荔枝果色的形成是多种色素共同作用的结果，不同的荔枝品种果皮色素的变化规律各不相同。大多数早熟品种颜色比晚熟品种浅，且色泽分布不均匀；随着成熟期的推迟，荔枝果皮的色泽饱和度也逐渐增加。其中妃子笑提取物的L*、b*值最大。
3.3 在相关性分析中可以看到，荔枝皮花色苷的含量、抗氧化活性与其在乙醇中溶解后粒径分布存在相关性，这是由于在高体积分数乙醇体系中，花色苷结构发生聚集，使之参与抗氧化反应的羟基数量减少，因而抗氧化活性降低。其色度和粒径的特性可以用作今后评定天然产物的抗氧化活性的物理指标。经过综合比较，得出糯米糍品种荔枝皮花色苷具有较好的工业使用价值。
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Correlation among Particle Size Distribution and Color Parameters in Aqueous Ethanol Solution and Antioxidant Activity of Anthocyanin Extracts from Different Varieties of Litchi Pericarp
ZHOU Wei-jing，LI Shu-yi，SUN Zhi-da*，XIE Bi-jun
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Anthocyanin extracts prepared from 9 varieties of litchi pericarp were compared for differences in particle size distribution in different concentrations of aqueous ethanol solutions and various color parameters such as L*, a*, b*, C* and h°.In the case of the extracts having different anthocyanin contents, the correlations among anthocyanin content, particle size distribution parameters and color parameters in 35% aqueous ethanol solution and maximum hydroxyl free radical scavenging rate or median effective concentration (EC50) were analyzed. Results indicated that Nuomici litchi pericarp anthocyanins dissolved in 35% aqueous ethanol solution showed the best particle size distribution (in the range of 2.48－6.51 μm) and the D50 and the specific surface area were 4.56 μm and 498.23 m2/kg, respectively. In addition, anthocyanin extracts prepared from different varieties of litchi pericarp revealed a significant difference in particle size distribution. Meanwhile, Nuomici litchi pericarp anthocyanins had the highest c* (110.27) and a* (87.12) values and Feizixiao litchi pericarp anthocyanins had the highest L*(94.86) and b* (98.79) values. The color of anthocyanin extracts prepared from different varieties of litchi pericarp changed from red to yellow. Correlations were observed among anthocyanin content, maximum hydroxyl free radical scavenging rate or IC50 and particle size distribution parameters and color parameters in 35% aqueous ethanol solution. Moreover, particle size distribution parameters exhibited a dominant effect on color parameters in 35% aqueous ethanol solution.
litchi pericarp anthocyanins；particle size；antioxidant activity；Lab color system；correlation analysis
TS272.5
A
1002-6630(2010)09-0001-05
2009-09-22
国家自然科学基金-广东省联合基金项目(U0731005)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD27B08)
周玮婧(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail：elfinlife221@163.com
孙智达(1963—)，男，教授，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：sunzhida@mail.hzau.edu.cn
