郑晓文，陈一强，孔晋亮，张剑锋，经庆玲
目前，肺癌仍是癌症导致的死亡中的首要原因，是一种具有高转移潜能的高侵袭性恶性肿瘤，有很大一部分的肺癌明确诊断的时候已经处于晚期，错过最佳的治疗时机。异常激活的Hedgehog信号通路已经在很多肿瘤中发现，如基底细胞癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等[1-5]。Hedgehog信号通路有SHH、DHH、IHH 3个配体，其中最常见的是SHH，通过与ptch1结合，解除对SMO的抑制，启动Gli-1核转录，激活HH靶基因的转录。Hedgehog信号通路成分的异常高表达常与肿瘤增强的迁移和侵袭能力相关[6]。Hedgehog信号通路的靶基因常是生长因子或生长因子受体，包括胰岛素样生长因子2(IGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)[7]。本研究通过检测人肺癌组织中的Hedgehog信号通路主要成分SHH、Gli-1及靶基因VEGF的表达，分析其与不同临床病理特征的相关性。
1 材料与方法
1.1 临床资料 选取2013年3—10月广西医科大学第一附属医院临床病理明确诊断为肺癌，并行外科手术治疗的患者72例为研究对象，取癌组织及癌旁组织(距离癌组织5 cm)。其中男40例，女32例；年龄33～84岁，平均(57.7±13.1)岁；腺癌50例，鳞癌12例，小细胞癌4例，其他6例。有吸烟史36例，术前有化史4例。另选取同时期良性肺病变组织30例为对照组，其中男18例，女12例；年龄39～67岁，平均(45.8±10.3)岁；包括支气管扩张12例，肺结核球9例，肺炎性假瘤5例，肉芽肿性炎3例，肺气肿1例。本研究取得广西医科大学第一附属医院伦理审查委员会的审查批准。
1.2 实验材料 RNA样品保存液(TIANGEN，DP408)；反转录试剂盒〔宝生物工程(大连)有限公司〕；定量PCR试剂盒(Roche)；SHH抗体(Santa Cruz，sc-1194)，Gli-1抗体(Santa Cruz，sc-20687)，VEGF单克隆抗体(Origene，TA500042)。
1.3 实时荧光定量PCR引物序列 在美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因库查到相应的基因序列，采用Oligo 5.0进行引物设计，然后在NCBI上进行Primer-BLAST，采用评分最高的引物序列。引物序列的合成由北京六合华大基因科技股份有限公司合成(见表1)。
1.4 免疫组织化学法检测肺癌组织SHH、Gli-1、VEGF的表达 将取得的癌组织、癌旁组织、良性肺病变组织经甲醛溶液固定后，石蜡包埋切片，热修复后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，3%过氧化氢(H2O2)室温孵育20 min，PBS冲洗3次，滴加一抗(SHH 1∶50，Gli-1 1∶75，VEGF 1∶100)，4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次，加入酶标二抗，室温孵育20 min，PBS冲洗3次，二氨基联苯胺(DAB)显色3～5 min，镜下监控显色程度。蒸馏水冲洗3次，Mayer苏木素10～20 s，分化，返蓝。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜下观察结果并拍照。镜下可见相应定位区域出现明显棕黄色颗粒为阳性，按阳性细胞数和染色强度进行半定量:0分：无阳性细胞，1分：阳性细胞≤25%，2分：阳性细胞26%～50%，3分:阳性细胞>50%；按染色强度:0分：无着色，1分：浅棕色，2分：棕黄色，3分：棕褐色。每张切片两项得分相乘:0分为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为中阳性，>4分为强阳性。3分以上定为阳性表达。
表1 引物序列及产物长度Table 1 Primer sequences and the length of amplified products
注：VEGF=血管内皮生长因子
1.5 实时荧光定量PCR检测肺癌组织的SHH、Gli-1、VEGF mRNA的表达 将癌组织、癌旁组织、良性肺病变组织用0.9%氯化钠溶液清洗后放入至RNA样本保存液中，存至-80 ℃冰箱中。肺癌组织在研钵中碾碎后，用RNA提取试剂盒提取组织总RNA，电泳判断总RNA的完整性，反转录试剂盒获得cDNA，进行实时荧光定量PCR反应，反应体系20 μl〔Mix 10 μl，上游引物(10 μmol/L)0.6 μl，下游引物(10 μmol/L)0.6 μl，cDNA 1 μl，双蒸水7.8 μl〕。反应条件95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min(40个循环)。60 ℃收集荧光。软件生成的标准曲线R2均大于0.99，扩增效率为90%～110%。按以上体系以及条件分别测定待测样本目的基因及内参的Ct值，2-ΔΔCt法计算基因表达的差异。
2 结果
2.1 SHH、Gli-1、VEGF在肺癌组织、癌旁组织、良性肺病变组织的表达情况 SHH、Gli-1、VEGF阳性染色均呈棕黄色，SHH主要表达在肺癌组织的肿瘤细胞中，定位在胞质。Gli-1和VEGF在肺癌组织中主要表达在胞质中(见图1)。
肺癌组织中SHH阳性表达率为73.6%(53/72)，癌旁组织为16.7%(12/72)，良性肺病变组织为6.7%(2/30)，差异有统计学意义(χ2=64.819,P<0.05)；其中肺癌组织和癌旁组织SHH阳性表达率高于良性肺病变组织，肺癌组织SHH阳性表达率高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.01)。肺癌组织中Gli-1阳性表达率为30.6%(22/72)，癌旁组织为8.3%(6/72)，良性肺病变组织为6.7%(2/30)，差异有统计学意义(χ2=15.300,P<0.05)；其中肺癌组织和癌旁组织Gli-1阳性表达率高于良性肺病变组织，肺癌组织Gli-1阳性表达率高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.01)。肺癌组织中VEGF阳性表达率为75.0%(54/72)，癌旁组织为69.4%(50/72)，良性肺病变组织为16.7%(5/30)，差异有统计学意义(χ2=34.530,P<0.05)；其中肺癌组织和癌旁组织VEGF阳性表达率高于良性肺病变组织，差异均有统计学意义(P<0.01)。
2.2 SHH、Gli-1、VEGF阳性表达率与肺癌患者临床病理特征的关系 不同性别、年龄、吸烟史、分化程度、术前放化疗肺癌患者Gli-1阳性表达率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同淋巴结转移、远处转移、TNM分期、早晚期、分化程度、病理类型、术前放化疗肺癌患者VEGF阳性表达率比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。
2.3 SHH、Gli-1、VEGF mRNA在肺癌组织、癌旁组织、良性肺病变组织的表达情况 肺癌组织中SHH mRNA相对表达量为(60.857±5.446)，癌旁组织为(10.848±1.600)，良性肺病变组织为(25.763±2.178)，差异有统计学意义(F=110.982,P<0.05)。肺癌组织中Gli-1 mRNA相对表达量为(9.804±1.054)，癌旁组织为(5.661±0.612)，良性肺病变组织为(3.551±0.545)，差异有统计学意义(F=59.183,P<0.05)。肺癌组织中VEGF mRNA相对表达量为(0.574±0.051)，癌旁组织为(0.495±0.027)，良性肺病变组织为(0.357±0.030)，差异有统计学意义(F=6.061,P<0.05)。
2.4 SHH、Gli-1、VEGF mRNA相对表达量与肺癌患者临床病理特征的关系 不同性别、吸烟史、TNM分期、分化程度、病理类型、术前放化疗肺癌患者Gli-1 mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同分化程度、术前放化疗肺癌患者VEGF mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。
表2 SHH、Gli-1、VEGF阳性表达率与肺癌患者临床病理特征的关系〔n(%)〕Table 2 Correlations of SHH，Gli-1，VEGF expression with clinicopathologic characteristics in human lung cancer
注：-为Fisher确切概率法
2.5 肺癌组织中SHH、Gli-1和VEGF的表达与mRNA相对表达量的相关性分析 肺癌组织中SHH、Gli-1和VEGF的表达与mRNA相对表达量均呈正相关(P<0.05，见表4)。
3 讨论
Hedgehog信号通路在脊柱动物中呈保守状态，在哺乳动物的发育过程中高度激活，特别是神经管和骨骼中，但是随即沉默在大多数成熟组织中。然而，一些生后成熟的器官，比如中枢神经系统、肺脏，在损伤后依靠持续的Hedgehog信号通路来维持组织的内环境稳定和修复[8]。异常调节的Hedgehog信号通路在肿瘤一系列关键生物过程中起作用，如细胞增殖、细胞周期的调节、抗凋亡蛋白的下调、EMT形成和干细胞信号途径[9]。
表4 肺癌组织中SHH、Gli-1和VEGF的表达与mRNA相对表达量的相关性分析
Table4 Correlation analysis of protein and mRNA level of SHH,Gli-1 and VEGF
r值P值SHH0 7180 000Gli-10 7960 000VEGF0 8740 000
表3 SHH、Gli-1、VEGF mRNA相对表达量与肺癌患者临床病理特征的关系Table 3 Correlations of SHH,Gli-1 and VEGF mRNA expression with clinicopathologic characteristics in human lung cancer
注：*为F值
呼吸道损伤修复期上皮组织内Hedgehog信号通路被广泛激活，通过调控干细胞/祖细胞的增殖分化，促进组织修复[10]。目前Hedgehog信号通路在肺癌中表达的研究结果不尽相同。Watkins等[10]用7个小细胞肺癌(SCLC)细胞系和7个非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系在体外培养，这些肺癌细胞系均表达SHH，7个SCLC有5个同时表达SHH和Gli-1；NSCLC中SHH表达下降，均无Gli-1表达。有学者用免疫组织化学法检测40例SCLC组织中Gli-1表达率为34例(85%)，其中26例为中阳性或强阳性，同时检测18种SCLC细胞系，仅有一种表达Gli-1，提示Gli-1在体内的表达高于体外[11]。
本研究中72例肺癌中腺癌50例，鳞癌12例，小细胞癌4例。其中36例腺癌、8例鳞癌、3例SCLC SHH表达阳性，14例腺癌、6例鳞癌Gli-1表达阳性，40例腺癌、10例鳞癌VEGF表达阳性。SHH及Gli-1的阳性表达率与病理类型无关，VEGF在腺癌中的表达率高于鳞癌和小细胞癌。在研究中共纳入4例有化疗史的患者，术前均进行3或4次化疗，病理类型为腺癌，具体的化疗方案不详，Gli-1阳性表达率明显高于未化疗的肺癌组织，VEGF的表达却低于化疗后肺癌组织。这与目前的肺癌化疗的耐药性形成有关，肺癌组织在药物的作用下产生了某些适应性的变化，可导致多种分子和信号通路异常，当激活Hedgehog信号通路则异常表达Gli-1。而VEGF的变化则是多种因素共同作用下的结果。
持续激活的Hedgehog信号通路成分——SMO可以在促进人SCLC细胞的克隆形成，促进鼠SCLC的发生和发展，药理阻断Hedgehog信号通路则可以抑制人和鼠SCLC的生长，尤其是化疗后更加明显，显示Hedgehog信号通路在SCLC的发展和维持中起着重要的细胞内作用[12]。本研究在72例肺癌组织中检测到SHH、Gli-1、VEGF的阳性表达率均高于良性肺病变组织，表明人肺癌组织有异常激活的SHH信号通路，高表达的SHH配体启动SHH信号通路传导，导致Gli-1的转录，作用于靶基因VEGF，发挥其在肿瘤发生、发展中的调控作用。SHH、Gli-1、VEGF在蛋白水平和基因水平表达呈一致性，表明其在基因水平后翻译修饰表达至蛋白水平，整个过程呈连续一致性。Raz等[13]的研究结果同样表明Hedgehog信号通路下游成分以SHH为主，并且在NSCLC中主要以SHH配体依赖的方式发挥作用。
肺癌组织中SHH、Gli-1阳性表达率高于癌旁组织,VEGF阳性表达率在肺癌组织和癌旁组织无差异。具有高转移倾向的器官表现出明显的血管生成倾向，高表达VEGF，从而可以刺激巨噬细胞产生金属基质蛋白酶(MMPs)，降解局部细胞外基质(ECM)，从而使肿瘤细胞增殖[14]。VEGF还可以作为重要成分激活内皮细胞中的αvβ3整合素，在肿瘤的转移和侵袭中发挥着重要的作用[15]。本研究中VEGF肺癌组织和癌旁组织中同样高表达，VEGF在伴有远处转移、淋巴转移的肺癌组织中高表达，与其在肿瘤发生过程中促进血管生成的重要作用相关。
Hedgehog信号通路抑制剂GDC-0449可以抑制肺腺癌和SCLC细胞系的细胞生长，增加顺铂的细胞毒效应[16]。Hedgehog信号通路主要成分SHH、Gli-1及VEGF在肺癌中高表达，与肿瘤的发展密切相关，提示基于抑制Hedgehog信号通路及VEGF抑制剂的联合治疗是肺癌分子靶向治疗的一项有效措施，可以提高肺癌生物综合治疗的有效性。
注：A为SHH阴性，B为SHH弱阳性，C为SHH中阳性，D为SHH强阳性，E为Gli-1阴性，F为Gli-1弱阳性，G为Gli-1中阳性，H为Gli-1强阳性，I为VEGF阴性，J为VEGF弱阳性，K为VEGF中阳性，L为VEGF强阳性
图1 肺癌组织、癌旁组织、良性肺病变免疫组织化学法染色(×400)
Figure1 Immunohistochemical staining of human lung cancer tissue,cancer adjacent tissue and benign lung lesions
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