张 淼，马素娜，张海燕，高 亮
·论著·
·中医·中西医结合研究·
人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征肺脾气虚证的病理机制研究
张 淼，马素娜，张海燕，高 亮
目的 探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)肺脾气虚证患者载脂蛋白(Apo)AⅠ、ApoAⅡ、ApoB、锌α2-糖蛋白(AZGP1)表达水平的差异，为研究HIV/AIDS中医证候提供依据。方法 2013年12月—2014年6月选取河南省某地区的HIV/AIDS肺脾气虚证患者28例为HIV/AIDS肺脾气虚证组(FP组)。同期选取同地区健康人16例为对照组(JK组)。采集研究对象血清，检测CD4、CD8水平及CD4/CD8，采用iTRAQ-MS技术鉴定ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平。结果 FP组CD4水平低于JK组，CD4/CD8小于JK组(P<0.05)；两组CD8水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组iTRAQ-MS技术鉴定ApoAⅠ水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；FP组iTRAQ-MS技术鉴定ApoAⅡ水平高于JK组，iTRAQ-MS技术鉴定ApoB、AZGP1水平低于JK组(P<0.05)。两组ELISA法检测ApoAⅠ水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；FP组ELISA法检测ApoAⅡ水平高于JK组，ELISA法检测ApoB、AZGP1水平低于JK组(P<0.05)。结论 HIV/AIDS肺脾气虚证患者血清中ApoAⅡ水平升高，ApoB、AZGP1水平降低，与脂质代谢有关。
艾滋病；肺脾气虚证；载脂蛋白
张淼，马素娜，张海燕，等.人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征肺脾气虚证的病理机制研究[J].中国全科医学，2016，19(33)：4083-4086.[www.chinagp.net]
ZHANG M,MA S N,ZHANG H Y,et al.Pathological mechanism of lung spleen qi deficiency syndrome in HIV/AIDS[J].Chinese General Practice，2016，19(33)：4083-4086.
本课题组近十多年一直致力于人类免疫缺陷病毒(HIV)/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)中医证候的研究，通过流行病学调查发现，肺脾气虚证是HIV/AIDS常见虚证证型[1]，并通过专家问卷调查[1]、研制HIV/AIDS中医证候诊断量表[2]、系统生物学研究[3-5]探索HIV/AIDS肺脾气虚证的中医病因、病理机制及证候的本质，为中医药防治AIDS提供思路和方法。蛋白质组学已被引入到中医证候的研究，通过对证候蛋白质表达谱进行分析，进而揭示中医证候的本质[6]。目前，蛋白质组学的研究主要集中于定量分析，在定量蛋白质组学领域，同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)是使用最广泛的技术。本课题组运用蛋白质组学iTRAQ标记结合质谱(MS)技术[7]研究发现，HIV/AIDS肺脾气虚证患者血清中载脂蛋白(Apo)AⅡ、ApoB、锌α2-糖蛋白(AZGP1)表达水平存在差异[3]。本研究运用酶联免疫吸附试验(ELISA)法对差异表达蛋白进行验证，以期发现HIV/AIDS肺脾气虚证的生物标志物，阐释HIV/AIDS肺脾气虚证的机制，为中医证候量化提供依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2013年12月—2014年6月选取河南省某地区的HIV/AIDS肺脾气虚证患者28例为HIV/AIDS肺脾气虚证组(FP组)。纳入标准：西医诊断标准参考《艾滋病诊疗指南(2011版)》[8]，有流行病学史，实验室检查HIV抗体阳性；中医证候诊断标准参考本课题组研制的HIV/AIDS肺脾气虚证中医诊断量表，包括气喘、易感冒、泄泻、自汗、痰稀、胸闷、消瘦、恶风寒、心悸心慌、舌淡、脉虚弱等症状。排除标准：有严重感染者，意识不清、痴呆、各种精神类疾病者或不愿意合作者。同期选取同地区健康人16例为对照组(JK组)。纳入标准：年龄18～60岁；无基础疾病。排除标准：原发性免疫缺陷病、激素化疗等引起的继发性免疫缺陷病、血液病、其他原因引起的中枢神经系统疾病；意识不清、痴呆、各种精神类疾病者或不愿意合作者。FP组男13例，女15例；年龄31～60岁，平均年龄(50.2±6.7)岁。JK组男8例，女8例；年龄30～57岁，平均年龄(47.6±6.9)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(χ2=0.015，P=0.902；t=1.332，P=0.195)。研究对象均签署知情同意书，本课题经过传染病国家科技重大专项“十二五”计划小组多轮评审通过并批准。
1.2 研究方法 采集研究对象清晨空腹血液5 ml，静置30 min，3 000 r/min离心5 min(离心半径20 cm)，取上清液，放入-80 ℃冰箱备用。
1.2.1 检测CD4、CD8水平及CD4/CD8采用FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)检测CD4、CD8水平，计算CD4/CD8。
1.2.2 iTRAQ-MS技术鉴定ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平 依据iTRAQ实验要求，每组设立4个生物学重复，利用安捷伦亲和离心小柱Human-14去除样本中的高丰度蛋白，进行蛋白酶解和定量，依据说明书进行iTRAQ标记，采用高效液相色谱系统对iTRAQ标记后的4个生物学重复混合后的肽段样品进行分离，并进行质谱分析。
1.2.3 ELISA法检测ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平 ELISA试剂盒购自美国Cloud-Clone公司。按照说明书要求，稀释血清样本，绘制标准曲线，检测ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1表达水平。
2 结果
2.1 CD4、CD8水平及CD4/CD8比较 FP组CD4水平低于JK组，CD4/CD8小于JK组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组CD8水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。
表1 两组CD4、CD8水平及CD4/CD8比较Table 1 Comparison of levels of CD4,CD8,and CD4/CD8 between the two groups
2.2 iTRAQ-MS技术鉴定ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平比较 两组iTRAQ-MS技术鉴定ApoAⅠ水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；FP组iTRAQ-MS技术鉴定ApoAⅡ水平高于JK组，iTRAQ-MS技术鉴定ApoB、AZGP1水平低于JK组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。
表2 两组iTRAQ-MS技术鉴定ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平比较Table 2 Comparison of levels of ApoAⅠ,ApoAⅡ,ApoB and AZGP1 detected by iTRAQ-MS technology between the two groups
2.3 ELISA法检测ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平比较 两组ELISA法检测ApoAⅠ水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；FP组ELISA法检测ApoAⅡ水平高于JK组，ELISA法检测ApoB、AZGP1水平低于JK组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。
3 讨论
肺脾气虚证作为HIV/AIDS常见的一种中医证候，包括气喘、易感冒、泄泻、自汗、痰稀、胸闷、消瘦、恶风寒、心悸心慌、舌淡、脉虚弱等症状。中医学认为，气是从中国古代哲学中继承而来，其是构成人体和维持人体生命活动的基本物质，气的推动作用不足，则气血生化乏源，出现消瘦、胸闷、心悸心慌等症状；气的温煦不足，则津液运行迟缓聚而生成痰饮，产热少则恶风寒；气的防御作用减退，患者易感冒；气虚不能固摄体内的津液，则会出现自汗、泄泻等症状。
表3 两组ELISA法检测ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平比较Table 3 Comparison of levels of ApoAⅠ,ApoAⅡ,ApoB and AZGP1 detected by ELISA method between the two groups
本课题组最初进行的河南省HIV/AIDS中医证候流行病调查显示，肺脾气虚证是HIV/AIDS常见的基本虚证证型[1]；通过对HIV/AIDS中医病因、病理机制的研究发现，AIDS发病机制主要是艾毒伤元(将HIV称为艾毒)，属于中医病因中的疠气，艾毒侵入人体易伤肺、脾、肾等脏器，形成以虚证为主、虚实夹杂的复杂病理表现[9]；进一步对HIV/AIDS中医证候进行客观化、标准化研究[10-11]，通过对肺脾气虚证的四诊信息及证候指标，采用Logistic回归、因子分析及结构方程模型进行定性定量分析，制定出HIV/AIDS肺脾气虚证中医诊断量表，并构建了AIDS中医证候数据库[12]。本研究采用iTRAQ-MS技术对HIV/AIDS中医证候进行蛋白质组学研究，运用ELISA法进行了验证，以期发现HIV/AIDS肺脾气虚证的生物标志物，阐释HIV/AIDS肺脾气虚证的机制，为中医证候量化提供依据。
Apo参与了脂蛋白的代谢过程，其在体内发生改变，就会影响到脂蛋白的生成、功能、代谢等，导致脂蛋白代谢紊乱，发生一系列的病理改变。ApoAⅠ、ApoAⅡ是高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白，而ApoB是构成低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白。吴剑锋等[13]研究发现，ApoAⅠ对HDL生成的影响，可为防治动脉粥样硬化提供新的思路和治疗靶点。范玉兰等[14]也认为，ApoAⅠ/ApoB可用来评估颈动脉斑块的危险程度。赵长新等[15]对1 038例农村高血压患者调查分析发现，患者血清中ApoB/ApoAⅠ升高与肥胖有关。蒋海霞[16]研究发现，在2型糖尿病患者中，ApoAⅠ、ApoB和脂蛋白的联合检测对患者早期诊断有意义。艾艳红等[17]对126例缺血性脑梗死患者血清检测分析发现，ApoB/ApoAⅠ较正常人升高，可作为实验室诊断指标。梁晶晶等[18]研究发现，ApoAⅠ、ApoB在膝关节骨性关节炎患者血清中的表达水平降低。雷成多等[19]通过对120例慢性丙型肝炎患者血清中ApoB、ApoAⅠ表达水平分析发现，ApoB/ApoAⅠ与肝损伤程度有关，与肝纤维化分期呈负相关。黎健等[20]也发现，ApoAⅡ可以保护内皮细胞的损伤，预防动脉粥样硬化。本研究结果显示，两组iTRAQ-MS技术鉴定、ELISA法检测ApoAⅠ水平均无差异；FP组iTRAQ-MS技术鉴定、ELISA法检测ApoAⅡ水平均高于JK组，iTRAQ-MS技术鉴定、ELISA法检测ApoB水平均低于JK组，提示HIV/AIDS肺脾气虚证患者存在脂代谢紊乱，血脂水平异常，可在下一步研究中检测HDL、LDL、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)水平，探索HIV/AIDS肺脾气虚证的作用机制，探讨HIV/AIDS肺脾气虚证患者与脂代谢紊乱相关疾病的关系及进一步发展趋势。AZGP1是一种糖蛋白，是一种新的脂肪因子[21]，动物实验研究发现，对高脂肪饮食造成的肥胖抗性大鼠血清检测发现，AZGP1表达水平明显增高；另有实验也证实，如果敲除AZGP1基因，AZGP1表达水平减少，引起脂肪生成基因表达水平增加，导致脂质水平升高[22]；研究者在治疗AIDS患者过程中也发现，脂质代谢障碍的AIDS患者常会出现胰岛素抵抗和血脂异常引起的动脉粥样硬化，血清AZGP1水平明显降低，并且与HDL、胆固醇水平呈正相关[23]。大量文献报道了AZGP1异常表达，尤其是表达下调与体内脂质代谢异常和肿瘤密切相关[24]。本研究结果显示，FP组iTRAQ-MS技术鉴定、ELISA法检测AZGP1水平均低于JK组，提示HIV/AIDS肺脾气虚证患者血清中脂类物质代谢紊乱，可能引起脂质水平升高。
在现代医学中，痰、湿多被认为是人体内脂类物质代谢障碍所导致的。而在中医学中，痰湿多被认为与脾脏、肺脏有关。痰湿困阻，清阳不升，造成疲乏无力、纳呆等症状。也有研究表明，AIDS疲劳患者血液中脂类物质表达异常[25]。肺脾气虚证日久气血生化乏源，正气不足，卫外功能受损则抵抗力下降，容易遭受邪气侵犯。本研究结果显示，FP组CD4水平低于JK组，CD4/CD8小于JK组，提示患者免疫力降低，表现为一系列的机会感染；正虚气血生化乏源，渐至气血亏虚，因虚致瘀；脾不运化水湿，痰湿内生，痰瘀互结。
综上所述，HIV/AIDS肺脾气虚证患者血清中ApoAⅡ水平升高，ApoB、AZGP1水平降低，与脂质代谢有关。本研究样本量偏小，在今后的研究中将扩大样本量，并采用更多的方法从不同方面行进一步的研究，为中医证候的标准化提供依据。
作者贡献：张淼进行试验设计与实施，撰写论文、成文并对文章负责；张海燕、高亮进行试验实施、资料收集；马素娜进行质量控制及审校。
本文无利益冲突。
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(本文编辑：崔丽红)
Pathological Mechanism of Lung Spleen Qi Deficiency Syndrome in HIV/AIDS
ZHANGMiao,MASu-na,ZHANGHai-yan,GAOLiang.AIDSInstitute,He′nanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China
Correspondingauthor:MASu-na,AIDSInstitute,He′nanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China;E-mail:907702957@qq.com
Objective To explore the difference of expression levels of ApoAⅠ,ApoAⅡ,ApoB and AZGP1 among patients with lung spleen qi deficiency syndrome and HIV/AIDS,and provide the basis for research of TCM syndrome features of HIV/AIDS.Methods From December 2013 to June 2014,28 HIV/AIDS patients with lung spleen qi deficiency syndrome from a certain area of He′nan province were selected as HIV/AIDS with lung spleen qi deficiency syndrome group (FP group).In the same period,16 healthy people from the same region were selected as control group (JK group).Serum of objects was collected,and the levels of CD4,CD8and CD4/CD8were detected.The levels of ApoAⅠ,ApoAⅡ,ApoB,AZGP1 were identified by iTRAQ-MS technology,and detected by ELISA method.Results The level of CD4and CD4/CD8in FP group were significantly lower than those in JK group (P<0.05).There was no significant difference in CD8level between the two groups (P>0.05).There was no significant difference in ApoAⅠ level identified by iTRAQ-MS technology between the two groups (P>0.05).The ApoAⅡ level identified by iTRAQ-MS technology in FP group was higher than that in JK group (P<0.05).Levels of ApoB and AZGP1 identified by iTRAQ-MS technology in FP group were lower than those in JK group (P<0.05).There was no significant difference in ApoAⅠ level detected by ELISA method between the two groups (P>0.05).The ApoAⅡ level detected by ELISA method in FP group was higher than that in JK group (P<0.05).Levels of ApoB and AZGP1 detected by ELISA method in FP group were lower than those in JK group (P<0.05).Conclusion ApoAⅡ level increased,levels of ApoB and AZGP1 decreased in serum of HIV/AIDS patients with lung spleen qi deficiency syndrome,and this is related to lipid metabolism.
HIV/AIDS;Lung spleen qi deficiency syndrome;Apolipoprotein
传染病国家科技重大专项“十二五”计划(2012ZX100050001-005)；河南中医学院2012年博士科研基金项目(BSJJ2012-12)
450046 河南省郑州市，河南中医药大学艾滋病研究所
马素娜，450046 河南省郑州市，河南中医药大学艾滋病研究所；E-mail：907702957@qq.com
R 512.91
A
10.3969/j.issn.1007-9572.2016.33.012
2016-03-10；
2016-09-08)
