由淑萍，从美丽，倪国华，詹怀峰，王红军，金 晶，马登娥，叶力夏提，赵志强，蒋 红，刘 涛
·论著·
哈萨克族原发性高血压病患者全血DNA甲基化位点筛查及异常甲基化谱的构建
由淑萍1，从美丽2，倪国华3，詹怀峰4，王红军5，金 晶6，马登娥7，叶力夏提4，赵志强1，蒋 红1，刘 涛8*
目的 应用基因芯片技术筛选哈萨克族原发性高血压病(EH)患者异常DNA甲基化位点，初步构建哈萨克族EH异常甲基化谱，为深入研究哈萨克族EH的发生机制提供理论依据。方法 2014年6月—2015年10月，在新疆乌鲁木齐县随机抽取哈萨克族牧民或半农牧民3 042例为调研对象，从其中的1 487例EH患者中随机选取3例作为EH组，并选取年龄匹配的3例健康者作为对照组。采用Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片对两组受试者的全血进行全基因组DNA甲基化检测，筛选DNA异常甲基化位点，采用Gene Ontology(GO)富集分析和Pathway分析了解异常甲基化基因的功能。结果 EH组和对照组间存在427个差异甲基化位点，其中高甲基化位点148个，低甲基化位点279个；这些位点位于不同的染色体上，其中以1号和6号染色体最多，Y染色体未见差异甲基化位点；GO富集分析结果显示，差异甲基化基因主要参与糖蛋白生物合成与代谢、血管发育、脉管系统发展、胶原蛋白结合等生物学过程；Pathway分析结果显示，差异甲基化基因主要参与了硫酸软骨素生物合成、胰岛素信号通路、胞吞等。结论 发生EH时DNA甲基化状态发生改变，多条差异甲基化基因与EH相关通路有关，但本研究仅是哈萨克族EH全基因组甲基化谱的开端，异常甲基化基因作为发生EH的候选分子标志物，若要获得更全面、更精确的结果，还需要进一步扩大样本量进行分析及验证。
高血压；哈萨克族；DNA甲基化；基因芯片
由淑萍，从美丽，倪国华，等.哈萨克族原发性高血压病患者全血DNA甲基化位点筛查及异常甲基化谱的构建[J].中国全科医学，2017，20(6)：678-683.[www.chinagp.net]
YOU S P,CONG M L,NI G H,et al.Blood screening for DNA methylation sites and construction of aberrant methylation profile in Kazak essential hypertensive patients[J].Chinese General Practice，2017，20(3)：678-683.
原发性高血压病(essential hypertension，EH)系一种常见的遗传性疾病，病因复杂，已成为心脑血管疾病最重要的致病危险因素[1]。尽管研究表明EH有显著的家族遗传性及聚集性，但目前单纯的全基因组DNA碱基序列检测对血压变异性的解释仍非常局限[2]；如同卵双生的两位EH患者，其血压值、患病时间及病情进展等诸多生物学特点并不完全相同，表观遗传学因素或参与其中。研究显示，哈萨克族为中国少数民族中EH患病率最高的民族，约为48.97%[3]，其中新疆巴里坤地区哈萨克族EH检出率为61.60%，明显高于汉族的38.60%[4]；而有关DNA甲基化在哈萨克族EH患者发病机制中的作用研究尚少[5-7]。DNA甲基化是目前研究最为清晰且重要的一类表观遗传修饰形式，当环境因素发生变化时即可引起相关基因的表达变化，进而影响整个基因网络或调控通路，导致异常表型。本研究采用Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片对哈萨克族EH患者和健康者的外周血样本进行全基因组表观遗传学关联研究(epigenome - wide association studies，EWAS)，分析组间差异甲基化位点，并对异常表达的甲基化基因进行生物信息学分析，了解其参与的生物学过程及调控的信号通路。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2014年6月—2015年10月，在新疆乌鲁木齐县随机抽取哈萨克族牧民或半农牧民3 042例为调研对象，其中EH患者1 487例，EH患病率为48.88%。从1 487例EH患者中随机选取3例作为EH组，并选取年龄匹配的3例健康者作为对照组。两组受
本研究背景：
高血压作为全球主要的公共健康问题，导致每年超过760万人死亡，是心脑血管疾病的最大危险因素。目前，全球高血压患病率逐年增加，中国成年人高血压患病率为18.8%，我国40岁以上男性高血压患病率为28.9%，女性为26.9%。据世界卫生组织预测，到2020年全球高血压患者将上升到1.5亿人。哈萨克族是我国群体遗传结构及高血压发病较有特点的一个民族，该民族长期生活在新疆干旱地区，为我国高血压患病率最高的5个民族之一。其高血压发病机制至今尚未完全阐明，但饮食因素可通过机体表观遗传学改变、DNA甲基化谱的改变导致机体对高血压易感。
试者均系男性；平均年龄(54.7±2.7)岁；均无心脑血管疾病；18 kg/m2≤体质指数(body mass index,BMI)<24 kg/m2。EH组纳入标准：参照2012年高血压防治指南中EH的诊断标准[8]，收缩压≥160 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)或舒张压≥100 mm Hg；正在服用降压药。
1.2 材料及仪器 DNA提取试剂盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕，Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片(美国Illumina公司)，EZ DNA MethylationTMKit(德国 QIAGEN公司)；Illumina HiScan Microarray Scanner system芯片扫描仪(美国Illumina公司)，低温离心机(美国SIGMA 公司)，鱼跃-台式血压计(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 体格检查和血样本采集 体格检查：测量身高、体质量、血压及腰围。测量两组受试者坐位右臂肱动脉血压，共3遍，取平均值记录。血样本采集：采集两组受试者晨起空腹肘正中静脉血3 ml，5%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，室温放置2 h后于-20 ℃冰箱冻存备用。
1.3.2 全基因组甲基化检测
1.3.2.1 全基因组DNA的提取 采用DNA提取试剂盒对6份血样本进行DNA提取。采用核酸蛋白测定仪检测血样本DNA浓度及纯度，2%琼脂凝胶电泳检测DNA完整性，结果显示全基因组DNA条带清晰，无杂带弥散带，且OD260/OD280介于1.8～2.0，总量>5 μg，为合格DNA，-80 ℃保存备用。
1.3.2.2 亚硫酸氢盐处理全基因组DNA 采用DNA CpG岛甲基化修饰试剂盒(EZ DNA MethylationTMKit)对待测DNA样品进行亚硫酸氢钠修饰。
1.3.2.3 全基因组扩增、杂交、扫描 亚硫酸氢钠修饰后每个样本进行全基因组的扩增、断裂、酶切片段；处理后的样本采用PCR纯化试剂盒进行纯化、沉淀、重悬，后经Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片上杂交、洗涤、延伸、染色、扫描等过程，获得DNA甲基化信号。信号的采集与芯片结果分析采用GenomeStudio®甲基化分析系统。
1.4 原始数据的质量控制 DNA甲基化比例背景数值矫正采用Illumina Human Methylaion 450K BeadChip芯片内置的标准对照位点。根据每个检测位点的重复杂交探针荧光信号强度的分布情况来计算该位点准确检出的P值，需去除任意样本中P>10-5的位点及本身即是单核苷酸多态性(SNP)或探针覆盖的区域内存在SNP。
1.5 芯片数据的处理 采用R软件minfi包对芯片的原始数据进行过滤、背景数值校正、数据归一化等预处理；采用R软件IMA包对样本分组间的甲基化位点和甲基化区域的差异进行筛选。差异甲基化基因的筛选标准：采用beta值衡量该位点甲基化程度。beta值区间为(0,1)，越接近于1表示该位点甲基化程度越高，越接近于0表示该位点甲基化程度越低。差异甲基化位点的筛选条件包括：(1)与对照组比较P<0.05；(2)|beta.difference|>0.14。
1.6 统计学方法 芯片原始数据采用R软件minfi包和IMA包进行数据处理，采用t检验方法对芯片数据处理后的差异甲基化位点进行组间筛选，按基因注释分类将基因分为TSS1500、TSS200、5′UTR、1stExon、gene body和3′UTR 6个区域，差异甲基化位点筛选到上述6个区域内。采用SAS统计学软件对差异甲基化位点进行层次聚类(Hierarchical Clustering)。采用GoMiner数据库进行生物信息学分析及Gene Ontology(GO)富集分析，采用KEGG数据库进行Pathway分析。
2 结果
2.1 芯片数据及样本的质量控制 每个样本均有2个密度峰值，未甲基化的密度峰值<0.2，甲基化的密度峰值>0.8；每个样本的beta值密度曲线趋于一致；EH组与对照组的样本在聚类分析后相似的样本分别出现在不同的簇中(样本分组符合试验设计需求，见图1，本文图1～2彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。
注：1、2、3为EH组；6、7、9为对照组
图1 EH组与对照组样本基线数据的质量控制图
Figure 1 Quality control charts of baseline data of EH and control group
2.2 差异甲基化位点及聚类分析 EH组和对照组间存在差异甲基化位点427个，其中高甲基化位点148个，低甲基化位点279个。按照基因注释分类，TSS1500区域存在59个差异化位点；TSS200区域存在35个差异化位点；5′UTR区域和1stExon区域存在47个差异化位点；gene body区域存在86个差异化位点；3′UTR区域存在10个差异化位点。对差异甲基化位点的beta值进行层次聚类分析发现，EH组存在较多高甲基化位点，而对照组存在较多低甲基化位点(见图2)。
图2 EH组与对照组样本差异甲基化位点聚类图
Figure 2 Clustering charts of differential methylated sites of EH and control group
2.3 差异甲基化位点的染色体分布 染色体定位分析可以挖掘高甲基化或低甲基化的基因是否有染色体的偏向性或成簇分布的特点，将样本分组间差异甲基化位点定位在染色体上，427个差异甲基化位点位于不同的染色体上，在1号染色体发现的差异甲基化位点最多，共41个，其次为6号染色体，共36个，再次是19号染色体，共32个；Y染色体未发现差异甲基化位点(见图3)。
2.4 DNA差异甲基化基因GO富集分析和Pathway分析 GO富集分析显示，差异甲基化基因主要参与糖蛋白生物合成过程、糖蛋白代谢过程、血管发育、脉管系统发展、胶原蛋白结合等多个生物过程(见表1)。同时，Pathway分析显示，差异甲基化基因主要参与了硫酸软骨素生物合成、胰岛素信号通路、胞吞等(见表2)。
3 讨论
表观遗传的修饰不涉及DNA碱基序列的改变，能导致基因表达的可遗传性变化，如DNA甲基化或组蛋白的乙酰化等[9-11]。DNA异常甲基化成为心脑血管疾病发生、发展的重要原因，而EH又是心脑血管疾病最重要的危险因素，已成为目前研究的热点[12]。在EH的致病因素中，全基因组许多调控基因的信息会因表观遗传学修饰的改变而改变，在基因序列未改变的情况下导致启动子、增强子等重要调控元件DNA甲基化，影响和调节基因的功能和特性，控制基因表达的时间、空间位置和表达方式。本研究从全基因组角度，探测哈萨克族EH患者DNA甲基化水平，并筛选甲基化位点，了解引发EH的相关基因参与分子功能、代谢过程、细胞组成等多个生物过程的作用，探寻其促进血管应激反应、调节细胞的吞吐及活力、促进组织细胞修复和血管功能构建的表观遗传学过程，以利于解决EH的发病、恢复问题，并为其发病的细胞和分子机制研究提供理论依据[13-15]。
图3 差异甲基化位点在染色体的分布情况
Table 1 GO enrichment analysis of differential methylated gene in EH group
涉及通路数量P值Benjamini值GO:0009101:糖蛋白生物合成过程a90.0014790.833960GO:0009100:糖蛋白代谢过程a100.0018470.674114GO:0001568:血管发育a110.0020040.555577GO:0001944:脉管系统发展a110.0023960.516900GO:0007155:细胞黏附200.0033800.560177GO:0022610:生物黏附200.0034330.501043GO:0070085:糖基化70.0082710.762870GO:0006486:蛋白氨基酸的糖基化70.0082710.762870GO:0043413:生物大分子的糖基化70.0082710.762870GO:0035295:血管的发展90.0108250.808013GO:0005518:胶原蛋白结合a40.0143950.997767GO:0007568:老化60.0175020.907424GO:0005976:多糖代谢过程60.0181300.891326GO:0034199:激活蛋白激酶A的活性30.0221070.915000GO:0005246:钙通道调节活性30.0238670.993810GO:0043062:细胞外结构组织70.0245770.919165GO:0004672:蛋白激酶活性160.0266040.977267GO:0035239:血管形态发生60.0302750.943215
注：a表示与EH发生、发展关系密切的生物学过程
表2 EH组差异甲基化基因Pathway分析
本研究运用DNA甲基化芯片的方法检测EH患者与健康受试者全血DNA差异甲基化位点，同时对差异甲基化基因进行GO富集分析和Pathway分析，共发现427个差异甲基化位点，初步建立了哈萨克族EH异常甲基化谱，但构建的哈萨克族EH异常甲基化谱在实际应用前仍需进行大样本量的验证。与对照组比较，EH患者DNA甲基化程度无论在CpG岛还是在启动子区，均呈现出明显的差异甲基化，即EH患者启动子区CpG岛整体表现为高甲基化状态。导致这些启动子区发生高甲基化的重要基因主要有3大类：一是糖蛋白生物合成和代谢基因，包括甘油酰基转移酶(diacylgycerol acyltransferase,DGAT)、N乙酰氨基半乳糖转移酶9(polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase 9,GALNT9)等，这些基因对脂肪代谢、脂类沉积和血脂水平有很大影响；二是与血管、脉管系统发展相关的基因，包括血管内皮细胞生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1/FLT1)、同源框转录因子2(caudal-type homeobox transcription factor 2,CDX2)、Meox家族中的Meox2等，这些基因参与了血管平滑肌细胞(VSMC)和心肌细胞周期的调控作用，在心血管系统发育过程中发挥作用[16-17]；三是与蛋白酶、钙通道及代谢相关的基因，如长链酯酰辅酶A合成酶家族3(long chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)等。
在差异甲基化基因Pathway分析中还发现，差异甲基化基因主要涉及的通路包括：(1)硫酸软骨素生物合成通路作为最积极的部分作用于哈萨克族EH患者的发病及病情进展中，分析原因为硫酸软骨素广泛存在于人的软骨组织中，哈萨克族人群高盐高脂饮食，而硫酸软骨素可以清除体内血液中的脂质和脂蛋白，清除胆固醇，并增加脂质和脂肪酸在细胞内的转换率；参与其中的主要基因包括XYLT1、UST、CHST3、DSE。(2)正常生理状态下，胰岛素可以通过磷酸肌醇3-激酶(PI-3K)途径促进血管舒张及生存，同时还通过有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径促进血管收缩并致有丝分裂，当胰岛素抵抗时，PI-3K途径转导的胰岛素信号变迟缓，但MAPK级联反应途径的信号依然如常，这些不平衡会使胰岛素抵抗者患EH及动脉粥样硬化的风险更高[18]。本研究结果也表明，胰岛素信号通路中的肾素-血管紧张素系统(RAS)在心血管系统中有表达，对EH的作用明显，涉及的基因包括CBLC、SOCS2、PYGL、PRKAR1B、RHEB、MAPK10、RPTOR。(3)胞吞作用在血管内皮细胞的迁移、血管组织损伤的修复及炎症发生等过程中发挥重要的作用，涉及的基因主要包括CBLC、FLT1、TGFBR1、MET、GRK5、IQSEC3、RAB11FIP1、CSF1R。
综上所述，基因芯片在技术可靠性得到保证的基础上，具有高灵敏度、高通量等特点，本研究表明EH患者DNA启动子区甲基化状态会发生改变，初步探索了DNA差异甲基化在EH中的作用，分析哈萨克族EH患者DNA甲基化基因显示，XYLT1、UST、CHST3、DSE、CBLC等差异甲基化基因与多条EH相关通路有关，本研究仅是哈萨克族EH全基因组甲基化谱的开端，作为EH的候选分子标志物，若要获得更全面、更精确的结果，还需要进一步扩大样本量进行分析及验证，为将来更好得研究哈萨克族EH的细胞信号转导通路、多个基因、蛋白、代谢产物及疾病发生提供基础依据。
作者贡献：由淑萍进行文章的构思与设计，由淑萍、从美丽、倪国华、詹怀峰、王红军、金晶、马登娥、叶力夏提、赵志强、蒋红、刘涛进行研究的实施与可行性分析；由淑萍、倪国华、詹怀峰、王红军、金晶、马登娥、叶力夏提、赵志强进行数据收集，由淑萍、赵志强、蒋红进行数据整理，由淑萍、赵志强进行统计学处理，由淑萍、从美丽、蒋红进行结果的分析与解释，由淑萍、从美丽、赵志强、蒋红进行论文撰写，由淑萍、从美丽进行论文修订，由淑萍、从美丽、蒋红、刘涛负责文章的质量控制及审校，由淑萍、从美丽对文章负责。
本文无利益冲突。
志谢：感谢新疆乌鲁木齐县甘沟乡卫生院、水西沟镇中心卫生院、小渠子乡卫生院、板房沟卫生院全体医务人员的大力支持和配合。
本研究不足之处：
环境危险因素如何通过调控机体遗传学特征，特别是表观遗传学特征，导致新疆哈萨克族原发性高血压病高发的机制尚未进行深入研究，将作为下一步的研究内容。
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(本文编辑：毛亚敏)
Blood Screening for DNA Methylation Sites and Construction of Aberrant Methylation Profile in Kazak Essential Hypertensive Patients
YOUShu-ping1,CONGMei-li2,NIGuo-hua3,ZHANHuai-feng4,WANGHong-jun5,JINJing6,MADeng-e7,YELIXIATI4,ZHAOZhi-qiang1,JIANGHong1,LIUTao8*
1.SchoolofNursing,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000，China2.MedicalLaboratoryAnimalCenter,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China3.TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China4.GangouHospital,UrumqiCounty,Urumqi830000,China5.XiaoquziHospital,UrumqiCounty,Urumqi830000,China6.ShuixigouCenterHospital,UrumqiCounty,Urumqi830000,China7.BanfanggouCenterHospital,UrumqiCounty,Urumqi830000,China8.SchoolofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054，China
Objective To screen aberrant DNA methylation sites of Kazak essential hypertension(EH) by using gene chip technique，and construct Kazak EH aberrant methylation profiles preliminarily，so as to provide a theoretical basis for intensive study of the mechanism of Kazak EH.Methods From June 2014 to October 2015,using random sampling method,3 042 Kazak herdsmen or semi-nomads were selected as the participants of this study from Urumqi County.Of them,1 487 had EH.And from the 1 487 EH patients,3 were randomly selected as the EH group,and other 3 age-matched healthy volunteers as the control group.Using Illumina Human Methylation 450K BeadChip,we measured the whole blood of all subjects for detecting DNA methylation and screening the aberrant methylation sites of DNA.We analyzed the function of abnormal methylation genes by using Gene Ontology(GO) enrichment analysis and Pathway analysis.Results There were 427 significantly differential methylated sites in EH and normal groups,where in 148 high methylation sites,279 low methylation sites;these sites were located on different chromosomes;among them,chromosome 1 and chromosome 6 were the most,no differential methylated site was found in Y chromosome.GO enrichment analysis showed that aberrant methylation genes mainly involved in the processes of glycoprotein biosynthesis and metabolism,vascular development,vasculature development,collagen binding and so on.Pathway analysis demonstrated that aberrant methylation genes mainly played a part in chondroitin sulfate biosynthesis,insulin signaling pathway,endocytosis and so forth.Conclusion The occurrence of EH involves in the changes in DNA methylation status.A number of differential methylated genes are related with EH associated signaling pathway.This study is only the beginning of construction of Kazak EH genome methylation profile,and the obtained aberrant methylation gene can be considered as a candidate early risk molecular marker of EH.However,more comprehensive and accurate study results need the analysis and verification of a larger sample.
Hypertension;Kazak;DNA methylation;Gene chip
新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2015211C020)
R 544.1
A
10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.009
2016-08-21；
2016-11-29)
1.830000新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学护理学院
2.830054新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学医学实验动物中心
3.830054新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院
4.830000新疆乌鲁木齐市乌鲁木齐县甘沟乡卫生院
5.830000新疆乌鲁木齐市乌鲁木齐县小渠子乡卫生院
6.830000新疆乌鲁木齐市乌鲁木齐县水西沟镇中心卫生院
7.830000新疆乌鲁木齐市乌鲁木齐县板房沟乡中心卫生院
8.830054新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学公共卫生学院
*通信作者：刘涛，教授；E-mail：xjmult@163.com
*Correspondingauthor:LIUTao，Professor；E-mail：xjmult@163.com
