刘 羽，李兆星，檀碧波，范立侨，赵 群，张 萌，徐志彬，李 勇*
·方法学研究·
应用基于色谱质谱联用技术的蛋白质组学鉴定筛选胃癌相关蛋白质
刘 羽1，李兆星1，檀碧波1，范立侨1，赵 群1，张 萌2，徐志彬3，李 勇1*
目的 应用基于色谱质谱联用技术(LC-MS)的蛋白质组学鉴定筛选胃癌相关蛋白质，并初步探讨其功能。方法 选取2011年4月—2012年9月于河北医科大学第四医院确诊为胃腺癌并进行手术切除者16例为研究对象。术中取患者胃癌组织及癌旁正常组织，采用基于LC-MS的蛋白质组学鉴定筛选胃癌组织及癌旁正常组织中的差异蛋白质，并应用免疫组化染色法验证筛选出的差异蛋白质。结果 基于LC-MS的蛋白质组学鉴定结果显示，胃癌组织与癌旁正常组织均鉴定了3 000～4 000种蛋白质，其中12种蛋白质差异显著，将其与GO数据库进行对比，去除二级节点中归类为“细胞组分”的结构蛋白质，在“分子功能”和“代谢过程”这两个节点中找到了4种可能与胃癌有关的蛋白质，即谷胱甘肽巯基转移酶-π-1(GST-π-1)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、丙酮酸激酶M2(PK-M2)、P120连环蛋白(P120-ctn)。免疫组化染色结果显示，胃癌组织中GST-π-1、PK-M2、P120-ctn阳性率大于癌旁正常组织，Cu/Zn-SOD阳性率小于癌旁正常组织(P<0.001)，与基于LC-MS的蛋白质组学鉴定结果相符。结论 基于LC-MS的蛋白质组学鉴定可筛选出胃癌相关蛋白质(GST-π-1、Cu/Zn-SOD、PK-M2、P120-ctn)，初步分析认为其与胃癌的多种细胞生物学活动有关，证实基于LC-MS的蛋白质组学鉴定在胃癌相关蛋白质筛选方面具有明显的应用价值。
胃肿瘤；气相色谱-质谱法；蛋白质组学
刘羽,李兆星,檀碧波,等.应用基于色谱质谱联用技术的蛋白质组学鉴定筛选胃癌相关蛋白质[J].中国全科医学，2017，20(9)：1088-1092.[www.chinagp.net]
LIU Y,LI Z X,TAN B B,et al.Identification and screening of proteins associated with gastric adenocarcinoma by proteomics based on liquid chromatography-mass spectrometry[J].Chinese General Practice，2017，20(9)：1088-1092.
胃癌对人类健康危害重大，胃癌标志物及其生物治疗相关作用靶蛋白是目前研究的热点[1-3]。蛋白质组学(proteomics)研究是以研究对象的总蛋白质为材料，通过分析、鉴定，对发挥作用的差异蛋白质进行分析，其对揭示肿瘤细胞的功能、生物学行为以及基因表达调控机制具有重要价值[4]。本课题组前期已成功进行了一些胃癌蛋白质组学研究[5-6]；本研究尝试应用色谱质谱联用技术(LC-MS)对胃癌组织直接进行蛋白质分离，通过与正常组织比对，寻找差异蛋白质作为新的胃癌标志物，以期为胃癌标志物筛选提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 研究材料
1.1.1 组织标本来源 选取2011年4月—2012年9月于河北医科大学第四医院确诊为胃腺癌并进行手术切除者16例为研究对象。其中男9例，女7例；年龄51～72岁，平均年龄(59.2±10.6)岁。纳入标准：(1)确诊为胃癌，手术切除肿瘤，病理为胃腺癌；(2)术前未接受过放化疗等治疗。排除标准：(1)术后复发或合并其他恶性肿瘤者；(2)长期应用激素或免疫抑制剂者；(3)不同意参加研究者。术中取患者胃癌组织及癌旁正常组织各1.0 cm×0.5 cm×1.0 cm。标本一式两份，一份置于-80 ℃保存用于蛋白质组学鉴定；另一份以中性甲醛固定，用于免疫组化检测。
1.1.2 主要试剂与仪器 胰蛋白酶(美国Promega公司)，盐酸胍(美国Sigma公司)，二硫苏糖醇(华美生物工程有限公司)，碘乙酰胺(美国EMD Chemicals公司)，乙腈(美国Thermo Fisher Scientific公司)，所有抗体及免疫组化试剂盒(美国Santa Cruz公司)，液质联用仪(LTQ XL型，美国Thermo Fisher Scientific公司)，金属浴(德国Eppendorf公司)。
1.2 研究方法
1.2.1 蛋白质样品制备 在研钵上用液氮研磨标本，制成干粉，放入EP管中，-80 ℃冰箱保存。加入100 μl盐酸胍(6 mol/L)、500 μl Tris-Hcl(50 mmol/L，pH=8.0)，4 ℃下12 000 r/min离心15 min(离心半径15 cm)，取上清液，重复离心(方法同上)2次；取上清液，放入新的EP管中，取100 μl样本(尽量不要吸到最上层的油层)，加入1 μl 二硫苏糖醇，金属浴上37 ℃加热30 min；加入5 μl碘乙酰胺，室温
本研究创新点与不足：
(1)近年来通过蛋白质组学研究筛选肿瘤相关蛋白质已取得了一定成果，但应用基于色谱质谱联用技术(LC-MS)的蛋白质组学鉴定筛选胃癌相关蛋白质的研究较为少见。本研究应用基于LC-MS的蛋白质组学鉴定筛选出4种胃癌相关蛋白质——谷胱甘肽S转移酶-π-1(GST-π-1)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、丙酮酸激酶M2(PK-M2)、P120连环蛋白(P120-ctn)，为胃癌标志物筛选做出了一定贡献。
(2)本研究由于技术复杂，研究成本较高，因而样本例数有限，需进一步扩大研究规模；另外，本研究所筛选得到的差异蛋白质尚需要深入研究探讨其在胃癌中的具体功能。
避光放置40 min，加入600 μl 50%丙酮、50%乙醇、0.1%醋酸混合液，-20 ℃放置12 h，4 ℃下12 000 r/min离心15 min(离心半径15 cm)，弃上清液；加入70%乙醇1 ml，4 ℃下12 000 r/min离心15 min(离心半径15 cm)，弃上清液；加入100 μl碳酸氢铵(50 mmol/L)溶解、混匀；加入胰蛋白酶2 μl，4 ℃放置16 h，4 ℃下12 000 r/min离心15 min(离心半径15 cm)；取上清液，放入超滤管，4 ℃下12 000 r/min离心15 min(离心半径15 cm)，取上清液，浓缩至15 μl，加入15 μl 含有1‰甲酸的水溶液后进入液质联用仪进行蛋白质组学鉴定。
1.2.2 基于LC-MS的蛋白质组学鉴定 酶解后的蛋白质样品利用LC-MS进行蛋白质组学鉴定。多肽混合物经纳升液相进行液相分离，分离所用色谱柱为C18反相柱(100 μm×150 mm)，梯度洗脱(0.4 μl/min，流动相A为含有1‰甲酸的纯水，流动相B为含有1‰甲酸的纯乙腈)，流动相B浓度从0～50%共经历85 min，分离后的混合物经电喷雾进入LTQ XL质谱仪进行质谱鉴定，其中喷雾电压为2 kV，加热毛细管温度为250 ℃。采用数据依赖方式进行二级谱图生成，一级谱图扫描范围为400～2 000 m/z，CID碎裂能量设为35%，Q值设为0.25，动态排除循环时间设为30 s，排除2个最高离子。
生成的raw data谱图利用BioWorks 3.3.1软件进行分析，比对所用数据库为人类蛋白质NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库，母离子偏差设定为2 Da，子离子偏差设定为1 Da，胰蛋白酶酶解位点最大值设为2。固定修饰为半胱氨酸还原烷基化，可变修饰为甲硫氨酸氧化，过滤值设为Delta CN≥0.100；Xcorr(±1，2，3)=1.9，2.5，3.75；peptide probability≤1e-005，假阳性率控制在1%以内。
1.2.3 免疫组化染色 应用SP法对胃癌组织与癌旁正常组织进行免疫组化染色，按试剂盒说明书进行操作。在高倍显微镜(×400)下每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，由2位病理医师分别双盲阅片进行结果判断。谷胱甘肽S转移酶-π-1(glutathione S-transferases-π-1，GST-π-1)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PK-M2)、P120连环蛋白(P120-catenin，P120-ctn)以细胞膜和/或细胞质呈黄褐色为染色阳性。
1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件进行数据录入。免疫组化染色结果中胃癌组织与癌旁正常组织蛋白质阳性率比较比较采用χ2检验。所得到的蛋白质通过GO(gene ontology)数据库(http://www.geneontology.org/)进行分子功能的注释。
2 结果
2.1 基于LC-MS的蛋白质组学鉴定结果 胃癌组织与癌旁正常组织均鉴定了3 000～4 000种蛋白质，其中12种蛋白质差异显著，并且将其与GO数据库进行对比，去除二级节点中归类为“细胞组分”的结构蛋白质，在“分子功能”和“代谢过程”这两个节点中找到了4种可能与胃癌有关的蛋白质，即GST-π-1、Cu/Zn-SOD、M2-PK、P120-ctn(见表1，胃癌组织与癌旁正常组织差异蛋白质的二级谱图请见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。
表1 基于LC-MS的蛋白质组学鉴定结果
Table 1 Proteins probably associated with gastric adenocarcinoma identified by proteomics based on LC-MS
编号蛋白质名称人类蛋白质NCBI数据库中蛋白质编号相对分子质量等电点蛋白质打分覆盖率(%)表达情况1GST-π-11151445723180.56.6870.2849.30a2Cu/Zn-SOD22573398216361.11.8220.1916.35b3PK-M229532205859962.81.9020.288.00a4P120-ctn29497976165255.60.9510.1855.48a
注：GST-π-1=谷胱甘肽S转移酶-π-1，Cu/Zn-SOD=铜锌超氧化物歧化酶，PK-M2=丙酮酸激酶M2，P120-ctn=P120连环蛋白；表达情况中，a为在胃癌组织高表达，b为在癌旁正常组织高表达
2.2 免疫组化染色结果 胃癌组织中GST-π-1、Cu/Zn-SOD、PK-M2、P120-ctn阳性率分别为75.0%(12/16)、31.3%(5/16)、68.8%(11/16)、68.8%(11/16)，癌旁正常组织中GST-π-1、Cu/Zn-SOD、PK-M2、P120-ctn阳性率分别为18.8%(3/16)、68.8%(11/16)、31.3%(5/16)、25.0(4/16)。胃癌组织中GST-π-1、PK-M2、P120-ctn阳性率大于癌旁正常组织(χ2=10.165、4.500、6.149，P=0.001、0.034、0.013)，Cu/Zn-SOD阳性率小于癌旁正常组织(χ2=4.500，P=0.034；见图1～2)。
注：GST-π-1=谷胱甘肽S转移酶-π-1，Cu/Zn-SOD=铜锌超氧化物歧化酶,PK-M2=丙酮酸激酶M2,P120-ctn=P120连环蛋白
图1 胃癌组织免疫组化染色结果(SP法，×200)
Figure 1 Gastric adenocarcinoma tissues stained by immunohistochemistry
图2 癌旁正常组织组化染色结果(SP法，×200)
3 讨论
蛋白质组学研究思路与既往研究不同，是从研究对象的总蛋白质水平出发，通过分析比较差异蛋白质，确定影响肿瘤生物学功能的重要蛋白质，其在研究开始前并不确定研究对象，而是通过筛选鉴定而最终确定蛋白质的结构和功能状态，在肿瘤的诊治中有良好的应用前景[7-8]。LC-MS将色谱的分离能力与质谱的定性功能相结合，对成分复杂的混合物仍可精确地进行定量和定性分析，对肿瘤研究具有十分重要的意义。
胃癌是我国常见恶性肿瘤，对其标志物及治疗靶蛋白的筛选有重要临床价值。目前胃癌组织相关蛋白质组学的研究中，应用LC-MS的文献鲜有报道。本研究应用LC-MS对胃癌组织及癌旁正常组织的差异蛋白质进行了筛选确定，结果显示，胃癌组织与癌旁正常组织均鉴定了3 000～4 000种蛋白质，其中12种差异蛋白质，并且将其与GO数据库进行对比，去除二级节点中归类为“细胞组分”的结构蛋白质，在“分子功能”和“代谢过程”这两个节点中找到了4种可能与胃癌有关的蛋白质，即GST-π-1、Cu/Zn-SOD、M2-PK、P120-ctn，这些蛋白质参与了细胞信号转导、肿瘤细胞代谢、细胞氧化损伤、维持细胞稳态、抗肿瘤酶系等细胞生物学活动，可能参与了肿瘤的发生、侵袭及转移等过程。GST-π-1分子量为23 kD，具有代谢有毒化合物、保护细胞免受急性毒性化学物质攻击、抗突变、抗肿瘤酶系等作用[9-10]，与人类肿瘤关系密切，其也可维持遗传物质稳定性，在癌组织表达水平低于正常上皮组织，缺乏GST-π-1功能的正常上皮细胞易受到各种致瘤因素的攻击。超氧化物歧化酶(SOD)主要有3种类型，即Cu/Zn-SOD、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)，其中Cu/Zn-SOD主要存在于细胞质中，是生物体内一种重要的氧自由基清除剂，通过平衡机体的氧自由基，达到避免因机体内超氧阴离子自由基浓度过高而引起不良反应的目的，在抗衰老、防辐射、抑制肿瘤和癌症、抗炎、自身免疫治疗等方面具有独特的功能，与肿瘤发生和进展有关[11]。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是糖酵解途径相关酶，分为PK-M和PK-L两种同工酶，PK-M又分为PK-M1、PK-M2亚型。研究表明，PK-M2影响肿瘤细胞凋亡，对于肿瘤细胞的增殖起重要作用[12-13]。P120-ctn是位于细胞连接处和细胞核内armadillo连环蛋白家族中的亚家族成员，其通过在细胞膜处与E-钙黏蛋白(E-cadherin)相互作用而参与E-cadherin介导的细胞黏附过程[14]。E-cadherin在肿瘤上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及恶性肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用；P120-ctn与E-cadherin形成的钙黏蛋白-连环蛋白复合体表达水平发生变化时会影响细胞分化、增殖等生物学行为，还可诱发肿瘤侵袭、转移[15]。本研究采用免疫组化染色对鉴定出的蛋白质进行验证，结果显示，胃癌组织中GST-π-1、M2-PK、P120-ctn阳性率大于癌旁正常组织，Cu/Zn-SOD阳性率低于癌旁正常组织，与蛋白质组学鉴定结果相符，说明研究结果具有较高可信度。
本研究发现蛋白质组学鉴定对于一些极酸、极碱、低丰度、难溶蛋白质的检测仍存在一定难度，因而有许多重要蛋白质的信息可能会丢失；其次，蛋白质图谱分析系统及数据库尚不十分成熟，对结果可能会造成一定影响；同时，本研究尚存在蛋白质组学鉴定前未进行分离比较、所得数据量过大及样本量较小等缺点，可能影响结果的准确性。总之目前应用基于LC-MS的蛋白质组学鉴定探寻胃癌标志物尚属于临床前研究，仍需大量临床试验加以验证。
综上所述，本研究应用基于LC-MS的蛋白质组学鉴定筛选出了与胃癌相关的蛋白质-GST-π-1、Cu/Zn-SOD、PK-M2、P120-ctn，初步分析认为其与胃癌的多种细胞生物学活动有关，证实基于LC-MS的蛋白质组学鉴定在胃癌相关蛋白质筛选方面具有明显的应用价值。但本研究所得为初步结果，相关蛋白质的具体功能还有待深入研究。
作者贡献：刘羽进行研究设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；李兆星、檀碧波、范立侨、赵群、张萌、徐志彬进行研究实施、评估、资料收集；李勇进行质量控制及审校。
本文无利益冲突。
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(本文编辑：崔丽红)
Identification and Screening of Proteins Associated with Gastric Adenocarcinoma by Proteomics Based on Liquid Chromatography-mass Spectrometry
LIUYu1,LIZhao-xing1,TANBi-bo1,FANLi-qiao1,ZHAOQun1,ZHANGMeng2,XUZhi-bin3,LIYong1*
1.TheThirdDepartmentofGeneralSurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China3.DepartmentofEndoscopy,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China
*Correspondingauthor:LIYong,Professor;E-mail:li_yong_hbth@126.com
Objective To identify and screen the proteins associated with gastric adenocarcinoma by proteomics based on liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS),and to explore the functions of these proteins.Methods Sixteen consecutive patients diagnosed as gastric adenocarcinoma and treated with surgery in Fourth Hospital of Hebei Medical University from April 2011 to September 2012 were selected.The differentially expressed proteins in human gastric adenocarcinoma tissues and adjacent normal tissues taken intraoperatively were identified and screened by proteomics based on LC-MS,and then tested by immunohistochemistry.Results As the results of proteomics based on LC-MS showed,3 000-4 000 proteins were identified in gastric adenocarcinoma tissues and adjacent normal tissues,including 12 significantly differentially expressed proteins.The results were compared with the relative data in GO database.Of the second-level nodes,the structural proteins classified as cellular component were ruled out,and in nodes of "molecular function" and "metabolic process",4 proteins probably associated with gastric adenocarcinoma were selected,which included glutathione S-transferase-π-1(GST-π-1),Cu/Zn superoxide dismutase(Cu/Zn-SOD),pyruvate kinase M2(PK-M2),P120-catenin(P120-ctn).Results of immunohistochemistry revealed that positive rates of GST-π-1,PK-M2,and P120-ctn were higher in gastric adenocarcinoma tissues than in adjacent normal tissues(P<0.001),whereas positive rates of Cu/Zn-SOD were lower in gastric adenocarcinoma tissues than in adjacent normal tissues(P<0.001),which were in accordance with proteomics based on LC-MS.Conclusion Proteins associated with gastric adenocarcinoma(GST-π-1,Cu/Zn-SOD,PK-M2,and P120-ctn) identified with proteomics based on LC-MS,are considered to be related to the multiple cell biological activities of gastric adenocarcinoma via preliminary analysis,which suggests that it is valuable to identify gastric adenocarcinoma associated proteins with proteomics based on LC-MS.
Stomach neoplasms;Gas chromatography-mass spectrometry;Proteomics
国家自然科学基金资助项目(81372580)；河北省科技支撑项目(11276103D-26)；河北省医学科学研究重点课题计划项目(20160168)
R 735.2
A
10.3969/j.issn.1007-9572.2017.09.013
2016-09-08；
2016-12-30)
1.050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院外三科
2.050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院肝胆外科
3.050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院内镜室
*通信作者：李勇，教授；E-mail：li_yong_hbth@126.com
