邱二娟，葛玲燕，陈娟，任利军
·论 著·
补肾健脾方改善宫内发育迟缓的作用及分子机制研究
邱二娟1，葛玲燕1，陈娟1，任利军2
1.浙江中医药大学附属杭州市中医院妇一科，浙江杭州 310007；2.河南中医药大学第一附属医院妇产科，河南郑州 450099
研究补肾健脾方改善胎鼠宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation，IUGR）的作用及分子机制。将妊娠SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，对照组给予常规饲料喂养，后4组采用低蛋白饲料喂养的方式建立IUGR模型；对照组和模型组给予生理盐水灌胃，每日1次，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予1/2等效剂量、等效剂量、2倍等效剂量的补肾健脾方灌胃，每日1次，各组在妊娠第1～18天连续给药，妊娠第18天时剖宫产取胎盘及胎鼠，测量胎鼠的体质量、体长、胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）、胰岛β细胞功能指数（homeostasis model assessment-β，HOMA-β）以及胎盘、胎鼠骨骼肌中磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylation protein kinase B，p-AKT）、葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）的表达水平。模型组胎鼠的体质量、体长、HOMA-β以及胎盘、胎鼠骨骼肌中p-PI3K、p-AKT、GLUT1的表达水平低于对照组，HOMA-IR高于对照组（<0.05）；低剂量组、中剂量组、高剂量组胎鼠的体质量、体长、HOMA-β以及胎盘、胎鼠骨骼肌中p-PI3K、p-AKT、GLUT1的表达水平高于模型组，HOMA-IR低于模型组（<0.05）；高剂量组的各项测量指标与对照组比较，差异无统计学意义（>0.05）。补肾健脾方可改善胎鼠IUGR及胰岛素抵抗，激活胎盘、骨骼肌中PI3K/AKT/GLUT途径是补肾健脾方发挥上述改善作用可能发生的分子机制。
宫内发育迟缓；补肾健脾方；胰岛素抵抗；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B；葡萄糖转运蛋白1
胎儿宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation，IUGR）是一种病理妊娠状态，可导致胎儿宫内窘迫，甚至早产、新生儿窒息、死亡等不良妊娠结局，也会对患儿的远期产生不良影响、增加儿童时期发生认知障碍和多动症的风险[1-2]。祖国医学认为IUGR属“胎萎不长”的范畴，治疗重在养精血、益胎元、补脾胃、滋化源[3]。补肾健脾方为自拟经验方，由四君子汤及寿胎丸化裁而成，具体功效包括补肾健脾、气血双补、渗湿化瘀、标本兼治、补中寓利。笔者长期在临床实践中运用补肾健脾方进行治疗，但目前关于该方用于IUGR治疗的分子生物学证据较少。因此，本文以低蛋白及限制饮食方法建立的IUGR大鼠模型为对象，对补肾健脾方改善胎鼠IUGR的作用及分子机制展开研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 8周龄、SPF级SD雌性大鼠和雄性大鼠共40只，体质量200～220g，购自上海中科院实验动物中心（实验动物许可证号：X1702392）。动物实验遵循3C原则，获得浙江中医药大学附属杭州市中医院伦理委员会批准（伦理审批号：2022KY066）。
1.1.2 药物 补肾健脾方（党参30g、黄芪30g、淫羊藿15g、菟丝子15g、补骨脂12g、巴戟天12g、续断10g、白术10g、甘草6g）由浙江中医药大学附属杭州市中医院药剂科提供。
1.1.3 试剂与仪器 葡萄糖及胰岛素检测试剂盒购自上海邦景实业有限公司，总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化公司，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylation PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化AKT（phosphorylation AKT，p-AKT）的一抗购自CST公司，葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）、β-actin的一抗购自Abcam公司，正置光学显微镜凝购自上海永科光学仪器公司，胶成像仪购自上海勤翔仪器公司。
1.2 方法
1.2.1 分组与造模 雌性SD大鼠与雄性SD大鼠按照2:1的比例合笼，后进行阴道涂片，镜下见到精子判断为妊娠，作为妊娠第1天。将妊娠的雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各8只。对照组在妊娠期间给予常规饲料（蛋白含量18%，南通特洛菲饲料科技有限公司）喂养；模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组在妊娠期间给予低蛋白饲料（蛋白含量6%～8%，南通特洛菲饲料科技有限公司）喂养，以建立IUGR模型。
1.2.2 治疗方法 对照组和模型组均从妊娠第1天开始治疗，给予生理盐水10ml/kg灌胃，1次/d；低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予1/2等效剂量（6.3g/kg生药量）、等效剂量（12.6g/kg生药量）、2倍等效剂量（25.2g/kg生药量）灌胃，灌胃体积10ml/kg、1次/d。每组均连续给药至妊娠第18天。
1.2.3 体质量、体长检测 妊娠第17天时禁食过夜，于妊娠第18天时麻醉妊娠大鼠后剖宫取出胎鼠，称量胎鼠体质量、测量胎鼠体长。
1.2.4 胰岛素抵抗水平检测 断颈后在离心管内留取胎鼠血液标本约1ml，3000转离心10min，分离血清后检测空腹血胰岛素（fastng insulin，FINS）、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），计算胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）=FBG×FINS/22.5、胰岛β细胞功能指数（homeostasis model assessment-β，HOMA-β）=20×FINS/（FBG-3.5）。
1.2.5 mRNA表达水平检测 取妊娠大鼠的胎盘组织，胎鼠的骨骼肌组织，采用总RNA提取试剂盒提取组织中的总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒将组织中的总RNA反转录为cDNA，采用荧光定量检测试剂盒对cDNA中PI3K、AKT、GLUT1的表达水平，进行荧光定量PCR检测。按照试剂盒说明书配置反应体系：cDNA 1μl、反应混合液10μl、上下游引物各0.6μl，去离子水补足至20μl；按照试剂盒说明书设置PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃ 15s、特异性退火温度25s、72℃ 30s，共进行40个反应循环，得到循环曲线及循环阈值，以β-actin为内参，参照公式2–△△Ct计算PI3K、AKT、GLUT1的mRNA相对表达水平。
1.2.6 蛋白表达水平检测 取妊娠大鼠的胎盘组织，胎鼠的骨骼肌组织，加入裂解液提取组织蛋白，测定蛋白浓度后将含有30μg蛋白的样本用于检测。在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离不同分子量的蛋白，4℃孵育PI3K一抗（1: 500稀释）、p-PI3K一抗（1: 500稀释）、AKT一抗（1: 400稀释）、p-AKT一抗（1: 400稀释）、GLUT1一抗（1:800稀释）或β-actin一抗（1:5000稀释）过夜。次日室温孵育1:2000稀释的二抗1h，最后在凝胶成像系统中曝光得到条带，以β-actin为内参，计算p-PI3K、p-AKT、GLUT1的蛋白表达水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 24.0统计学软件对数据进行分析和处理，计数资料用例数（百分率）[（%）]表示，组间比较采用2检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-法，<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组胎鼠体质量、体长比较
模型组胎鼠的体质量、体长均低于对照组（<0.05），低剂量组、中剂量组、高剂量组胎鼠的体质量、体长均高于模型组（<0.05）；其中，低剂量组、中剂量组胎鼠的体质量、体长均低于对照组（<0.05），而高剂量组胎鼠的体质量、体长与对照组比较，差异无统计学意义（>0.05），见表1。
表1 各组胎鼠体质量、体长比较（）
注：与对照组比较，*<0.05；与模型组比较，#<0.05
2.2 各组胎鼠胰岛素抵抗水平比较
模型组胎鼠的HOMA-IR水平高于对照组、HOMA-β水平低于对照组（<0.05），低剂量组、中剂量组、高剂量组胎鼠的HOMA-IR水平低于模型组、HOMA-β水平高于模型组（<0.05）；其中，低剂量组胎鼠的HOMA-IR水平高于对照组、HOMA-β水平低于对照组（<0.05），而中剂量组、高剂量组胎鼠的HOMA-IR、HOMA-β水平与对照组比较，差异无统计学意义（>0.05），见表2。
表2 各组胎鼠胰岛素抵抗水平比较（）
注：与对照组比较，*<0.05；与模型组比较，#<0.05
2.3 各组胎盘中PI3K/AKT/GLUT1途径mRNA表达比较
各组胎盘中PI3K、AKT的mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（>0.05）。模型组胎盘中GLUT1的mRNA表达水平低于对照组（<0.05），低剂量组、中剂量组、高剂量组胎盘中GLUT1的mRNA表达水平高于模型组（<0.05）；低剂量组、中剂量组胎盘中GLUT1的mRNA表达水平低于对照组（<0.05），而高剂量组胎盘中GLUT1的mRNA表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（>0.05），见表3。
表3 各组胎盘中PI3K/AKT/GLUT1途径mRNA表达水平比较（）
注：与对照组比较，*<0.05；与模型组比较，#<0.05
2.4 各组胎鼠骨骼肌中PI3K/AKT/GLUT1途径mRNA的比较
各组胎鼠骨骼肌中PI3K、AKT的mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（>0.05）。模型组胎鼠骨骼肌中GLUT1的mRNA表达水平低于对照组（<0.05），低剂量组、中剂量组、高剂量组胎鼠骨骼肌中GLUT1的mRNA表达水平模型组（<0.05）；其中，低剂量组、中剂量组胎鼠骨骼肌中GLUT1的mRNA表达水平低于对照组（<0.05），而高剂量组胎鼠骨骼肌中GLUT1的mRNA表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（>0.05），见表4。
表4 各组胎鼠骨骼肌中PI3K/AKT/GLUT1途径mRNA表达水平的比较（）
注：与对照组比较，*<0.05；与模型组比较，#<0.05
3 讨论
西医治疗IUGR多采用低分子肝素改善胎盘血流灌注、补充营养物质等，效果并不理想[4]。祖国医学认为IUGR属“胎萎不长”的范畴，疾病的病位主要在脾、胃，辨证特征包括气血虚弱、脾肾不足、血寒宫冷、阴虚血热、血瘀等，治疗重在养精血、益胎元、补脾胃、滋化源。中医药治疗“胎萎不长”有其独到之处，经过数千年的临床实践积累了丰富的经验且疗效较好，临床实践中未见到对妊娠妇女及胎儿有不良影响。
补肾健脾方为四君子汤及寿胎丸化裁而成的自拟经验方，方中寿胎丸重在补先天肾精，精能生血，故使气血充调，胎元得养[5]；四君子汤益气健脾，白术“活血、利腰、长胎”，通达冲任、为安胎圣药；茯苓渗湿、助脾健运、以复血生化之源，正所谓“血足则胎自濡、血足则胎自安”[6]。笔者长期在临床实践中使用健脾补肾方治疗复发性流产、IUGR，但目前关于该方治疗IUGR的基础研究报道较少。
妊娠期间低蛋白饮食是IUGR常用的动物造模方法[7-8]，本研究从妊娠第1天起给予低蛋白饮食、在妊娠第18天时解剖胎鼠并对体质量和体长进行测量，结果显示：接受低蛋白饮食的模型组胎鼠体质量和体长均低于接受常规饮食的对照组，表明IUGR造模成功。在妊娠第1～18天时采用不同剂量补肾健脾方灌胃的方法对IUGR模型大鼠进行治疗，妊娠第18天时胎鼠的测量结果显示：不同剂量补肾健脾方治疗能明显增加胎鼠的体质量和体长，其中高剂量补肾健脾方治疗后IUGR胎鼠的体质量和体长与对照组比较相似，提示高剂量补肾健脾方能显著纠正胎鼠IUGR，使IUGR胎鼠的生长达到正常水平。
胰岛素是妊娠过程中保证胎儿生长发育的重要激素之一，胰岛素与胰岛素受体结合后通过下游PI3K/AKT进行信号转导，发生磷酸化的PI3K和AKT能够增加GLUT1的表达并促进葡萄糖转运，进而保证胎儿正常的生长发育[9-11]。在IUGR的发生、发展过程中存在胰岛素抵抗，包括母胎之间的胎盘以及胎儿的骨骼肌等组织中均存在胰岛素信号转导异常[12-14]。本研究对IUGR模型大鼠的检测结果也证实：模型组的胎鼠HOMA-IR水平明显增加，而胎盘组织及胎鼠骨骼肌组织中p-PI3K、p-AKT、GLUT1 mRNA的表达水平均明显降低，表明IUGR胎鼠存在胰岛素抵抗且IUGR胎盘、胎儿骨骼肌中PI3K/AKT通路激活受阻、GLUT1表达降低，多个组织中PI3K/AKT/GLUT1途径受抑制可能是导致IUGR发病过程中胰岛素抵抗的生物学机制。
国内一项动物实验研究证实：补肾健脾方改善卵巢早衰大鼠性腺功能的作用与激活AKT通路有关[15]，提示补肾健脾方对PI3K/AKT信号通路具有调控作用。另有相关的临床研究证实：补肾健脾方用于多囊卵巢综合征的治疗能够改善患者的胰岛素抵抗、激活AKT通路[16-17]。本研究使用不同剂量补肾健脾方对IUGR模型大鼠进行治疗后，胎鼠的胰岛素抵抗明显减轻且胎盘组织及胎鼠骨骼肌组织中p-PI3K、p-AKT、GLUT1的表达水平均明显增加，其中高剂量补肾健脾方治疗后IUGR胎鼠的胰岛素抵抗程度及PI3K/AKT/GLUT1途径的激活程度与对照组相当，提示高剂量补肾健脾方显著纠正IUGR胎鼠的胰岛素抵抗并使PI3K/AKT/GLUT1途径的功能恢复正常。
综上所述，不同剂量补肾健脾方均改善胎鼠IUGR及胰岛素抵抗，其中高剂量补肾健脾方能够是IUGR胎鼠的生长及胰岛素抵抗达到正常水平；补肾健脾方发挥上述改善作用的可能分子机制是激活胎盘、骨骼肌中PI3K/AKT/GLUT途径。
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Study on the effect and molecular mechanism of Bushen Jianpi recipe on intrauterine growth retardation
QIU Erjuan, GE Lingyan, CHEN Juan, REN Lijun
1.Department I of Gynecology, Hangzhou TCM Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 310007, Zhejiang, China; 2.Obstetrics and Gynecology Department, the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM, Zhengzhou 450099, Henan, China
To study the effect and molecular mechanism of Bushen Jianpi recipe on improving intrauterine growth retardation (IUGR) of fetal rats.Pregnant SD rats were randomly divided into control group, model group, low-dose group, middle dose group and high-dose group. The control group was fed with conventional diet, and the last four groups were fed with low protein diet to establish IUGR model. The control group and the model group were given normal saline by gavage once a day, and the low-dose group, the middle dose group and the high-dose group were given 1/2 equivalent dose, equivalent dose and twice equivalent dose of Bushen Jianpi recipe by gavage once a day. Each group was given continuous medication on the 1st to 18th days of pregnancy. At the 18th day of pregnancy, the placenta and fetal rats were taken by cesarean section, and the body weight, body length, insulin resistance index (HOMA-IR), and homeostasis model assessment-β (HOMA-β) of fetal rats, the expression level of phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase (p-PI3K), phosphorylated protein kinase B (p-AKT), glucose transporter 1 (GLUT1) in placenta and fetal rat skeletal muscle were detected.Body weight, body length and HOMA-β of fetal rats, the expression levels of p-PI3K, p-AKT and GLUT1 in placenta and fetal rat skeletal muscle in the model group were lower than those of the control group, and HOMA-IR was higher than that of the control group(<0.05). Body weight, body length and and HOMA-β of fetal rats, the expression levels of p-PI3K, p-AKT and GLUT1 in placenta and fetal rat skeletal muscle in the low-dose group, middle dose group and high-dose group were higher than those of the model group, and HOMA-IR was lower than those of the model group(<0.05). There was no significant difference of the above indexes between the high dose group and the control group (>0.05).Bushen Jianpi recipe can improve IUGR and insulin resistance of fetal rats, and the possible molecular mechanism is activating PI3K/AKT/GLUT pathway in placenta and skeletal muscle.
Intrauterine growth retardation; Jianpi Bushen recipe; Insulin resistance; Phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B; Glucose transporter 1
R714.5
A
10.3969/j.issn.1673-9701.2023.18.003
浙江省中医药科技计划项目（2022ZA106）
任利军，电子信箱：814509821@qq.com
（2022–12–09）
（2023–05–23）
