游秋云 王平 张舜波 黄攀攀 章程鹏
·基础研究·
酸枣仁汤对REM睡眠剥夺老年大鼠脑神经细胞凋亡及c-fos基因表达水平的影响
游秋云 王平 张舜波 黄攀攀 章程鹏
目的观察酸枣仁汤对快动眼 （REM）睡眠剥夺导致的老年大鼠脑皮层和海马部位神经细胞凋亡及cfos基因表达Fos蛋白水平变化的影响。方法将自然衰老24月龄W istar大鼠随机分成空白对照组（等容生理盐水），老年REM睡眠剥夺组（等容生理盐水），阳性对照组（舒乐安定0.18 mg／（kg·d）），酸枣仁汤低、高剂量组（12.96，25.92 g／（kg·d））。各组灌胃给药2周后，除空白对照组外其余各组用自制改良多平台法剥夺大鼠睡眠48 h制作老年大鼠REM睡眠剥夺模型。通过原位末端标记法 （TUNEL）测定各组大鼠大脑皮层和海马部位神经细胞凋亡水平，用免疫组化法检测c-fos基因表达Fos蛋白的水平变化，探讨酸枣仁汤对老年失眠引起的脑神经损害及c-fos基因表达变化的影响。结果与空白对照组比较，老年REM睡眠剥夺组大鼠脑皮层和海马部位神经凋亡细胞增多，Fos蛋白表达明显增高。与老年REM睡眠剥夺组比较，酸枣仁汤组脑神经凋亡细胞及Fos蛋白表达明显下降，但仍高于正常对照组。结论c-fos基因很可能参与了老年大鼠REM睡眠剥夺后的细胞凋亡过程，酸枣仁汤可能是通过抑制脑组织c-fos基因表达上调，抑制神经细胞凋亡而发挥脑保护作用。
老年失眠；酸枣仁汤；大鼠模型；机制
酸枣仁汤出自 《金匮要略》，由酸枣仁、茯苓、知母、川芎、甘草等五味药组成，诸药相伍共奏养血安神、清热除烦之功。临床主治由肝血不足，阴虚内热引起的虚烦不眠证。研究表明，该方具有镇静催眠、抗焦虑、抗应激、改善睡眠时相结构等作用［1-2］。课题前期研究通过促眠实验以及Morris水迷宫检测学习记忆实验，证实了酸枣仁汤的镇静催眠及改善学习记忆能力作用［3］，并与脑内氨基酸类神经递质的调节密切相关［4］。为了进一步探索酸枣仁汤改善睡眠质量及脑保护作用靶点，本课题拟对老年REM睡眠剥夺引起的大鼠脑神经细胞凋亡及关键基因进行检测，为酸枣仁汤治疗老年失眠提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物 自然老年健康24月龄W istar大鼠，雌雄各半，50只，体重（500±60）g，由湖北省实验动物研究中心提前订购提供，许可证号SCXK（鄂）2008-0005。
1.2 药物与试剂 酸枣仁汤由酸枣仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g组成。全部药材购自湖北中医药大学附属医院药房，常规方法 （以上方药加5倍于药材的温水，浸泡30 min后微火煎煮15 min，文火煎20m in，滤出药渣，分别将药液浓缩成每毫升含生药0.648 g、1.296 g的药液。）煎煮后经水提制成浓度为64.8%、129.6%，分装灭菌后4℃保存备用。分别按12.96、25.92 g／（kg·d）剂量（按体表面积系数换算，分别为人体临床等效剂量的2倍和4倍）给药。舒乐安定片 （山西亨瑞达制药有限公司生产，批号111203）。
1.3 仪器与设备 睡眠剥夺箱 （自制），长72 cm×宽48 cm×高30 cm的鼠箱，内置6个直径为8 cm、高8 cm的平台，平台间隔16 cm，平台与鼠箱箱体壁间隔8 cm，在平台周边注满水，水面距平台面约1.0 cm，大鼠在平台上可自行饮食饮水，并可在不同平台上自由活动，于箱体上放平行的不锈钢丝笼罩，上面放水和食物；环境对照箱 （自制），与睡眠剥夺箱相似，但在距其底部8.0 cm处不放置平台，而是放置一面细密铁丝网，大鼠在网上可自由活动，其他条件均与睡眠剥夺组相同，以形成与睡眠剥夺组相似的环境。
1.4 动物分组及给药 将自然老年24月龄W istar大鼠50只（雌雄各半），随机分成5组，每组10只：空白对照组；老年REM睡眠剥夺组；舒乐安定组 （阳性对照组）；酸枣仁汤低、高剂量组。酸枣仁汤由酸枣仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g组成。舒乐安定组大鼠按0.18 mg／（kg·d）给药，酸枣仁汤低、高剂量组分别按12.96、25.92 g／（kg·d）给药，给药容量均为2 m l／100 g。每日1次，连续2w。空白对照组、老年REM睡眠剥夺组均灌服等容积生理盐水。
1.5 REM睡眠剥夺大鼠模型的制备 对模型组大鼠采用改良多平台水环境法［5］，放置于自制的睡眠剥夺箱进行REM睡眠剥夺48 h。空白对照组则放置于环境对照箱中。
1.6 大鼠大脑神经细胞凋亡检测 将大鼠处死后分别取脑皮质及海马区组织，4%多聚甲醛的固定，常规石蜡包埋，连续冠状切片［6］。通过原位末端标记法（TUNEL，TdT-mediated dUTP -biotin nick end labeling）测定大鼠大脑皮层和海马部位神经细胞凋亡水平，具体方法按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行免疫荧光染色，用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察，高倍视野下（40×10）计数200个神经元细胞中阳性细胞数。
1.7 c-fos基因表达Fos蛋白水平检测 采用免疫组化法检测c-fos基因表达Fos蛋白的水平变化［7］。分别进行Fos蛋白免疫组化染色，每张切片随机取三个视野，光镜下观察细胞浆中阳性细胞数。
2 结果
2.1 各组对老年REM睡眠剥夺导致的大鼠大脑神经细胞凋亡的影响 与空白对照组比较，老年REM睡眠剥夺组大鼠大脑皮质、海马部位神经细胞凋亡数明显增高（P＜0.01）；与老年REM睡眠剥夺组比较，酸枣仁汤低、高剂量组大鼠大脑皮质、海马部位神经细胞凋亡数明显减低（P＜0.01）。见表1。
2.2 各组对老年REM睡眠剥夺大鼠大脑c-fos基因表达Fos蛋白表达水平的影响 与空白对照组比较，老年REM睡眠剥夺组大鼠大脑皮质、海马部位c-fos基因表达Fos蛋白水平明显增高（P＜0.01）；与老年REM睡眠剥夺组比较，酸枣仁汤低、高剂量组大鼠大脑皮质、海马部位cfos基因表达Fos蛋白水平明显降低（P＜0.05、P＜0.01）。见表2。
表1 酸枣仁汤对老年REM睡眠剥夺大鼠大脑皮质、海马神经细胞数的影响（±s）
表1 酸枣仁汤对老年REM睡眠剥夺大鼠大脑皮质、海马神经细胞数的影响（±s）
注：与空白对照组比较，aP＜0.01；与老年REM睡眠剥夺组比较，bP＜0.01
组别 只数 剂量／（g·kg） 海马 皮质空白对照组 10 等容31±8 33±10空白对照组 10 等容 31±8 33±10空白对照组 10 等容 31±8 33±10舒乐安定组 10 0.18×10-3 92±21b 101±32b酸枣仁汤低剂量组 10 12.96 45±12b 56±21b酸枣仁汤高剂量组 10 25.92 41±9b 52±16b
表2 酸枣仁汤对老年REM睡眠剥夺大鼠大脑皮质、海马部位Fos蛋白表达水平的影响（±s）
表2 酸枣仁汤对老年REM睡眠剥夺大鼠大脑皮质、海马部位Fos蛋白表达水平的影响（±s）
注：与空白对照组比较，aP＜0.01；与老年REM睡眠剥夺组比较，bP＜0.05，cP＜0.01
组别 只数 剂量／（g·kg） 海马 皮质空白对照组 10 等容23±6 27±7老年REM睡眠剥夺组 10 等容 69±13a 71±11a舒乐安定组 10 0.18×10-3 58±8b 53±16c酸枣仁汤低剂量组 10 12.96 42±11c 39±11c酸枣仁汤高剂量组 10 25.92 39±9c 37±10c
3 讨论
前期实验采用D-半乳糖复制亚急性衰老大鼠模型［3，8］，虽然自由基水平接近自然衰老大鼠，但是由于该衰老模型是由化学损伤造成的，难以真实反映衰老的生理生化改变，因此本课题改进造模方法而选用自然老年24月龄W istar大鼠，采用国际上公认的多平台水环境法剥夺睡眠48 h，建立老年REM睡眠剥夺大鼠模型。
有研究表明，失眠对中枢神经系统的毒性作用包括思维紊乱、反应迟钝、注意力分散、定向障碍以及学习记忆受损等，睡眠剥夺24 h可使人的认知能力下降30%～40%，持续48 h，认知能力下降则高达60%～70%［9-10］。原癌基因c-fos属于立即早期基因，属核内蛋白类细胞癌基因，其特点是细胞外各种刺激均能诱导相应的脑功能区神经元及神经胶质细胞的c-fos原癌基因快速、短暂地表达［11］。它不但参与细胞分裂、生长分化、信息识别与传递、学习和记忆等生理活动，而且与动物行为及多种疾病的发生发展密切相关，并且同动物的清醒水平也有一定的关系［12］。原癌基因c-fos表达的核磷蛋白（Fos）被认为是在外界刺激与转录偶联的信息传导过程中起着核内第三信使的作用［13］。
有报道睡眠剥夺可引起c-fos表达增加［14］，灵芝多糖可改善SD大鼠的空间记忆情况，这与降低海马区c-fos表达有关［15］。因此本课题对cfos基因表达Fos蛋白指标进行了检测，实验结果提示，酸枣仁汤可能通过降低大脑c-fos基因表达水平、减少大脑神经细胞凋亡而对老年失眠大鼠起到脑保护作用。结合课题前期酸枣仁汤的促眠实验以及检测学习记忆能力的Morris水迷宫实验结果，多角度表明酸枣仁汤可改善睡眠质量、具有脑保护作用。
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Effect of Suanzao-Rentang on Neuronal Apoptosis and c-fos Gene Expression of Aged Rats with Rapid Eye Movement Sleep Deprivation
You Qiuyun，Wang Ping*，Zhang Shunbo，Huang Panpan，Zhang Chengpeng.*Pharmaceutical Institute，Hubei College of Traditional Chinese Medicine
ObjectiveTo observe the effect of Suanzao-Rentang on neuronal apoptosis and c-fos gene expression in Fos protein levels in cortex and hippocampus of aged ratswith rapid eyemovement（REM）sleep deprivation.MethodsNatural aging 24 months old W istar ratswere random ly divided into control group（isovolumetric saline），REM sleep deprivation elderly group（isovolumetric saline），positive control group estazolam 0.18mg／（kg·d），Suanzao-Rentang low and high dose group 12.96，25.92 g／（kg·d）.Each group was given intragastric administration for two weeks，then each group except the control group ismade REM sleep deprivation for 48h to producemodel of old rats with homemade improved multi-platform.The nerve cells apoptosis of cortex and hippocampus in the rats from each group are determ ined by situ end labeling（TUNEL）and level changes in c-fos gene expression to Fos protein are detected by using immunohistochem istry and explore the effect of suanzao-Rentang on the nerve damage and c-fos gene expression change in elder，which caused by insomnia.Resu lts Compared with the control group，the cerebral cortex and hippocampus nerve cells apoptosis of rats，which are from REM sleep deprivation group，increased，and their Fos protein expression was significantly.Compared with REM sleep deprivation older group，Suanzao-Rentang group’s nerve cells apoptosis and Fos protein expression in brain significantly decreased，but still higher than the normal control group.ConclusionC-fos gene is likely involved in the process of apoptosis in old REM sleep deprivation rats and Suanzao-Rentang inhibit neuronal apoptosis and play a protective role in the brain possibly by inhibiting brain upregulation of c-fos gene.
Elderly insomnia；Suanzao-Rentang；Model rats；Mechanism
国家自然科学基金（NO.81072849）
湖北中医药大学药学院 （游秋云、张舜波、黄攀攀、章程鹏）；430065湖北中医药大学国家中医药管理局老年性痴呆醒脑益智重点研究室 （游秋云、王平）
王平，E-mail：pwang54＠aliyun.com
