GSTP1和RASSF1A在前列腺癌组织中的甲基化检测及其表达研究

张永旺　武振华　冯少勇　柯鑫文　张雁钢

【摘要】目的：研究前列腺癌和前列腺增生组织中GSTP1和RASSF1A基因的甲基化差异及其蛋白表达情况，探讨GSTP1和RASSF1A基因甲基化作为前列腺癌早期诊断的价值，并揭示该基因甲基化与前列腺癌的发生发展的关系。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法检测GSTP1和RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态，并运用免疫组化SP染色法检测前列腺癌组织中GSTP1和RASSF1A基因的蛋白表达情况。结果：前列腺癌组织中GSTP1和RASSF1A基因甲基化检出率均明显高于前列腺增生组织，差异均有统计学意义（GSTP1：76.00%vs3.33%，P<0.001；RASSF1A：68.00%vs16.67%，P<0.001）。在前列腺癌中，GSTP1和RASSF1A蛋白阳性表达均明显低于前列腺增生组织，差异均有统计学意义（GSTP1：20.00%vs76.67%，P<0.001；RASSF1A：38.00%vs90.00%，P<0.001）。结论：GSTP1和RASSF1A基因异常甲基化可导致靶基因的蛋白表达降低，促进前列腺癌的发生发展。因此，GSTP1和RASSF1A基因在前列腺癌的发生、发展中起到重要作用，检测GSTP1和RASSF1A基因的甲基化有望成为前列腺癌早期诊断的分子标志物。

【关键词】前列腺癌； GSTP1； RASSF1A；甲基化；甲基化特异性聚合酶链反应

前列腺癌（PCa）是老年男性的常见疾病。PCa在欧美地区占男性恶性肿瘤首位，是导致发达国家男性癌死亡的主要原因[1]。我国PCa发病率较欧美低，但近年来，我国PCa的发病率呈现明显上升趋势。目前，血清前列腺特异性抗原（PSA）作为PCa的单一检测指标，虽然具有较高的PCa阳性诊断预测率，但它受到年龄、前列腺按摩、穿刺、感染、药物等因素的影响，致使其诊断的敏感性、特异性不高，不能充分满足临床需要，因此，PCa急需要敏感特异的生物标记物。

肿瘤是多因素参与、多基因变异积累、多阶段发生的复杂的病理过程。PCa的发病机制尚未明确，探索PCa的发病机制，将为PCa的早期诊断与治疗提供理论依据。DNA甲基化是表观遗传学的主要修饰方式之一，在基因表达的调控、基因结构的稳定等方面有重要作用，与肿瘤的发生发展关系密切[2]。进一步研究发现，PCa的临床分期与DNA甲基化密切相关，甲基化往往发生在肿瘤的早期，且甲基化频率随着疾病的进展而增高[3]。通过笔者对国内外PCa的甲基化研究文献进行检索，同时参考Ahmed[4]对PCa生物标记基因的预测。笔者预测GSTP1和RASSFIA最有可能成为PCa的早期生物标记，同时也有可能为疾病的预后提供更多提示。本研究旨在采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法检测PCa组织和前列腺增生（BPH）组织中谷胱甘肽-S-转移酶1（GSTP1）和RAS相关区域家族1（RASSF1）基因启动子区CpG岛甲基化改变；采用免疫组化SP染色法检测PCa组织和BPH组织中GSTP1和RASSF1的蛋白表达情况，进一步研究GSTP1和RASSF1A基因异常甲基化及靶蛋白的表达情况，探讨GSTP1和RASSFIA基因甲基化作为PCa早期诊断的价值及在PCa中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集山西医科大学附属第一临床医学院病理科PCa组织石蜡标本及BPH组织石蜡标本，分别进行组织DNA甲基化检测及免疫组化。其中经前列腺根治手术切除的PCa组织石蜡标本50例，患者年龄为51-82岁，平均（65.72±9.09）岁；BPH组织石蜡标本30例，患者年龄52-83岁，平均（66.13±10.23）岁。所有样本均经病理学诊断证实，且PCa患者术前均未进行化疗或放疗治疗。

1.2 主要试剂和仪器 OMEGA FFPE DNA Kit（50）；

Realtime PCR Master Mix；EpiTect Bisulfite Kits（48）；EpiTect Control DNA（100）；2×NI-Taq PCR MasterMix；鼠抗人GSTP1单克隆抗体、鼠抗人RASSF1A单克隆抗体；全自动酶标仪DG3022A型；PCR仪Applied Biosystems；凝胶成像系统AlphaImager HP。

1.3 方法

1.3.1 MSP方法根据文献[5-6]设计引物，具体序列如表1所示，ACTB引物参考文献；所有引物由Invitrogen公司合成。

PCa组织BPH组织分别进行DNA常规提取。提取的DNA经紫外分光光度计测定A260/A280比值在1.7～20之间的为合格标本，计算标本DNA浓度，按亚硫酸盐处理试剂盒说明书进行DNA甲基化修饰；取约50 ng亚硫酸处理后DNA作为模板，以NEB公司2×NI-Taq PCR MasterMix作为原料，以ACTB为内参，应用PCR仪器（Applied Biosystems）进行扩增反应。每次反应均设阳性对照，空白对照（双蒸水为阴性对照），每个样本重复3次。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，53/58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45个循环；最后72 ℃延伸15 min。然后在3%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后，采用凝胶成像系统成像，分析结果。

1.3.2 免疫组织化学方法 PCa和BPH石蜡组织切片经常规脱蜡后，放入3%双氧水-甲醇溶液中浸泡10 min，以封闭内源性过氧化物酶，经高压抗原热修复之后，滴加抗体（详细步骤按照说明书进行），经DAB显色，苏木精复染。每批染色用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察，结果采用半定量计分法判断，阳性细胞数打分：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度打分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；再由阳性细胞数及染色强度的乘积判断阳性等级：0～2分为阴性（-），3～8分为弱阳性（+），9～12分为强阳性（++）。

1.4 统计学处理采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，采用字2检验对GSTP1及RASSF1A基因在PCa与BPH组织中的甲基化率进行比较分析，同时采用相同的方法对靶蛋白的阳性强度进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSP法检测结果比较采用MSP法对50例PCa组织和30例BPH组织中的GSTP1基因及RASSF1A基因进行甲基化检测，50例PCa组织中GSTP1基因及RASSF1A基因启动子区高甲基化例数分别为38例和34例，甲基化率分别为76.00%和68.00%。30例BPH组织中，GSTP1基因及RASSF1A基因启动子区高甲基化例数分别为1例和5例，甲基化率分别为3.33%和16.67%，见表2。结果显示，PCa组织中GSTP1基因及RASSF1A基因启动子甲基化频率均明显高于BPH组织，差异均有统计学意义（P<0.001）。

表2 PCa组织和BPH组织中GSTP1和RASSF1A基因的甲基化检测

结果比较例

组别 GSTP1

RASSF1A

阳性阴性阳性阴性

Pca（n=50） 38 12 34 16

BPH（n=30） 1 29 5 25

字2值 39.628 19.776

P值 <0.001 <0.001

2.2 免疫组织化学法检测结果比较采用SP染色法对50例PCa组织和30例BPH组织中的GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白进行检测，50例PCa组织中GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白阳性反应的例数分别为10例和19例，阳性率分别为20.00%和38.00%。30例BPH组织中GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白阳性反应的例数分别为23例和27例，阳性率分别为76.67%和90.00%，见表3。结果显示，GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白在PCa组织中的表达均明显低于BPH组，差异均有统计学意义（P<0.001）。

表3 GSTP1和RASSF1A基因在PCa组织和BPH组织中的

表达比较例

组别 GSTP1

RASSF1A

阳性阴性阳性阴性

PCa（n=50） 10 40 19 31

BPH（n=30） 23 7 27 3

字2值 24.844 20.747

P值 <0.001 <0.001

3 讨论

DNA甲基化是一种调节基因表达的表观遗传学机制，它通过甲基化使抑癌基因和相关保护基因沉默，致使靶蛋白表达缺失，促进了PCa的发生、发展。本研究通过对GSTP1和RASSF1A基因在PCa组织中的甲基化检测及其靶蛋白表达研究，分析探讨GSTP1和RASSF1A基因甲基化在PCa的发生发展过程中的作用。

GSTP1基因定位于染色体11q13，GSTP1参与代谢、解毒和消除潜在的具有基因毒性的外来复合物，它能够代谢多种致癌化合物，起到保护细胞避免DNA损伤和癌细胞形成的作用，抑制GSTP1活性可以导致DNA损伤的敏感性增强和癌变发生的几率增加。笔者对GSTP1基因启动子区甲基化检测显示：PCa与BPH相比，GSTP1甲基化频率较高；这说明GSTP1在正常前列腺组织中以非甲基化形式存在，在PCa中多以高甲基化形式存在。结合免疫组化结果：GSTP1在正常前列腺上皮多呈现强阳性或阳性反应，而在PCa恶性上皮多呈阴性反应。结合以上研究，说明在BPH组织中GSTP1高表达而在PCa组织细胞中存在GSTP1低表达或表达缺失。研究提示在PCa中GSTP1启动子区高甲基化导致了靶蛋白表达降低甚至缺失，促进PCa的发生发展。

RASSF1A是Dammann等[6]与2000年发现的一种新型的抑癌基因，该基因的表达失活在人类多重肿瘤的发生发展中起着重要的作用。然而基因突变、缺失及DNA启动子区异常甲基化均可能导致RASSF1A基因的失活，人类肿瘤中的RASSF1A表达缺失是一个普遍事件，至少在37种肿瘤中存在RASSF1A启动子的异常甲基化[7-8]。现已有关于该基因的表达及其甲基化的检测报道[9-11]。笔者对RASSF1A基因启动子区甲基化检测显示：PCa组织中RASSF1A基因启动子甲基化率明显高于BPH，但是BPH中也有部分甲基化的发生。说明RASSF1A在PCa发生进展的过程中，RASSF1A基因的甲基化频率逐步增高。免疫组化方面：RASSF1A在BPH组织中的表达明显高于PCa组织，癌组织RASSF1A蛋白表达明显降低或缺失。结合上述两种方法，笔者认为RASSF1A基因启动子高甲基化可能造成该基因表达降低或失活，导致靶蛋白表达减少或缺失。这样的结果提示，RASSF1A基因可作为PCa早期诊断的分子标记物，同时为PCa的临床分期提供依据。

通过对GSTP1和RASSF1A基因的研究，笔者发现DNA启动子区CpG岛甲基化的发生致使蛋白低表达进而导致PCa的发生和进展。本研究中GSTP1基因的研究结果与国外Ellinger[12]报道结果基本一致，而与国内张彦等[13]研究结果不尽相同，这种差异的存在可能与样本量、实验方法或地域不同等因素有关，也有可能为样本有PCa和BPH组织并存、混杂等因素，因此检测GSTP1和RASSF1A基因甲基化作为PCa早期诊断的分子标记物，仍需进一步的扩大样本含量、改变实验方法或扩大研究范围来研究证实。

目前，在其他肿瘤中，遗传学和表观遗传学的改变已经应用于临床。PCa也需要新的检测和治疗方法。以上结果表明，在PCa的发生和发展中，GSTP1和RASSF1A最有可能成为PCa的早期生物标记，同时也将为PCa的诊断、治疗、预后提供重要价值。

参考文献

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（收稿日期：2014-03-06）（本文编辑：欧丽）