郑来 韩旭 李宏倬

【摘要】 全世界青少年和儿童都受到骨肉瘤的威胁，这种肿瘤主要好发于长骨干骺端，是该年龄段最常见的高度恶性骨肿瘤。早期肿瘤检测是有效治疗该疾病的关键，生物标志物的发现和对分子及其复杂相互作用的不断认识改善了骨肉瘤临床试验结果。本文简述了骨肉瘤的生物标志物，并重点介绍了骨肉瘤相关生物标志物的研究进展，以期对骨肉瘤临床治疗的进展产生积极影响。

【关键词】 骨肉瘤 化疗 治疗 恶性骨肿瘤 生物标志物

Research Progress of Biomarkers Related to Diagnosis and Treatment of Osteosarcoma/ZHENG Lai， HAN Xu， LI Hongzhuo. //Medical Innovation of China， 2021， 18（27）： -172

[Abstract] Adolescents and children all over the world are threatened by osteosarcoma， this tumor mainly occurs in the epiphysis of the long shaft， it is the most common highly malignant bone tumor in this age group. Early tumor detection is the key to the effective treatment of this disease. The discovery of biomarkers and the continuous understanding of molecules and their complex interactions have improved the results of clinical trials of osteosarcoma. This paper briefly describes the biomarkers of osteosarcoma， and focuses on the research progress of osteosarcoma related biomarkers， in order to have a positive impact on the progress of clinical treatment of osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma Chemotherapy Treatment Malignant bone tumor Biomarkers

First-author’s address： Graduate School of Changzhi Medical College， Changzhi 046000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.27.042

骨肉瘤是于1807年在“波耶尔讲座”首次提出的一种骨骼疾病。好发于20岁以下的儿童和青少年，男性发病率高于女性，每百万人约有8.7人患有骨肉瘤，是该年龄组中最常见的恶性骨肿瘤[1]。骨肉瘤多发于长骨干骺端（股骨远端43%，胫骨近端23%，肱骨近端10%）[2]，因此其主要症状包括患处肿胀、关节疼痛及活动受限。病理检查可提供明确的诊断及肿瘤分级信息。骨肉瘤大多数早期发生肺部转移，与肺转移患者相比，未转移患者五年生存率更高。新辅助化疗以及手术切除已经将此类患者5年生存率由1970年之前的10%提高到50%～70%。骨肉瘤的异质性是影响治疗效果的主要原因。生物标记物可用于诊断骨肉瘤患者，特别是骨肉瘤发生转移患者，生物标记物可能是早期诊断骨肉瘤以及确定潜在治疗靶点的有效途径。因此，本文针对这一方向综述了骨肉瘤细胞实验、动物模型及组织学标本中生物标记物的研究。

1 MicroRNA

MicroRNA或miRNA是高度保守、内源性、受到严格调控的非编码小RNA（18～25个核苷酸），通过直接降解或抑制翻译来靶向抑制mRNA转录。其主要在细胞凋亡、分化以及细胞周期等多项生物学过程中发挥作用，其表达受到表观遗传学（如DNA甲基化、组蛋白去乙酰化及其他转录调控机制）的严格调控。

miRNA可抑制癌基因或抑癌基因的表达，而这些基因在肿瘤发生过程中起着重要作用。以骨肉瘤为例，多个研究报道了不同miRNA在细胞系或样本中的表达谱[3]，例如miR-195、miR-99、miR-181及miR-148a在骨肉瘤中表达上调，而其他如miR-539、miR-145及miR-335在MG-63人类骨肉瘤细胞系中表达下调。

Cai等[4]进行了一项关于miRNA作为骨肿瘤标志物作用的研究，他们通过实时定量RT-PCR试验发现骨肉瘤患者血清中的miR-195水平低于正常对照组，表明miRNA具有作为骨肉瘤标志物的潜在可能，其可有效用于骨肉瘤的筛查与监测。Zhou等[5]进行的一项研究表明，血清miR-199a-5p在骨肉瘤样本中浓度较高。Ouyang等[6]测量了6个miRNA（miR-21、miR-199a-3p、miR-143、miR-34、miR-140和miR-132）的表达水平，发现miR-21在骨肉瘤患者中表达水平较高，而miR-199a-3p和miR-143在骨肉瘤患者中表达水平较低。

2 细胞因子

细胞因子是由单核细胞和巨噬细胞等分泌的小蛋白质，其是宿主对创伤、感染和免疫反应的调节因子。血浆中促炎细胞因子的异常升高与肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和癌症有关。多项研究表明与健康对照相比，骨肉瘤患者的转化生长因子（TGF-β）水平升高[7]。Tu等[8]的一项研究发现骨肉瘤细胞刺激间充质干细胞（MSCs）产生促肿瘤细胞因子的分泌，他们通过Saos-2和U2骨肉瘤细胞株的培养基刺激了MSCs中IL-6和血管内皮生长因子（VEGF）的产生，而TGF-β抗体可以中和这种作用。目前，抑制TGF-β的药物也已用于临床前研究和临床试验。而VEGF也被观察到在包括骨肉瘤在内的多种类型的癌症中上调，其参与骨肉瘤的血管生成，已被用作骨肉瘤患者预后的生物标志物。此外，VEGF的表达也与总生存率和无病生存率有关，VEGF表达高的患者无病生存率及总体生存率较低，这表明VEGF可能作为骨肉瘤预后的有效生物标志物。

Zhu等[9]研究了骨肉瘤患者细胞因子水平，他们发现，与正常对照组相比，试验组中包括ILS-6、TGF-β、生长相关癌基因、肝细胞生长因子、趋化因子配体16、内切蛋白酶、基质金属蛋白酶-9和血小板衍生生长因子-AA在内的21种细胞因子上调，并通过酶联免疫吸附（ELISA）试验得到证实，其中已知间充质干细胞分泌ILS-6可以促进骨肉瘤增殖和转移[10]。在另一项研究中，通过对骨肉瘤患者血清的免疫测定，发现β-异构化C端末端肽（β-CTx）和总1型前胶原氨基末端肽（tP1NP）显着升高。因此认为，这些蛋白质可以作为骨肉瘤生物标志物[11]。

TIM3表达异常与多种癌症有关，其属含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子（TIM）家族，并由包括T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞等在内的多种免疫细胞表达。Shang等[12]发现TIM3也在人类骨肉瘤细胞系中表达。此外，TIM3还被发现与已在骨肉瘤患者中检测到的Slug、Snail和Smad共表达。因此，TIM3有望作为诊断和治疗骨肉瘤的工具。

基质金属蛋白酶（MMPs）属于锌依赖性内肽酶家族，由巨噬细胞和中性粒细胞分泌，参与包括细胞外基质（ECM）降解和重构、形态形成、创面愈合、组织修复和重塑等多种生理和病理过程。此外，MMPs通过激活细胞生长、迁移、侵袭、转移和血管生成在肿瘤进展中发挥关键作用。一项研究表明在亚洲和非亚洲人群中，MMP-9的表达与骨肉瘤风险之间存在显着相关性[13]。

半乳糖凝集素是凝集素家族的β-半乳糖苷结合蛋白，其与细胞迁移，凋亡和分化等细胞过程有关。在这个家族的成员中，半乳糖凝集素1和3与胰腺癌、乳腺癌和胃癌以及骨肉瘤等癌症有关。Zhou等[14]的一项研究中发现骨肉瘤患者的血清半乳糖凝集素3水平高于正常对照组，并且在癌症晚期该蛋白水平越来越高。类似地，Lei等[15]的研究中发现半乳糖凝集素3在骨肉瘤组织和细胞系中过表达，敲除半乳糖凝集素3可抑制骨肉瘤细胞系的生长、迁移和侵袭。Park等[16]报告了类似的结果，他们证实半乳糖凝集素3的沉默导致骨肉瘤迁移和侵袭减少，这与侵袭介质（如Lyn、β-连环蛋白和Src）的表达减少有关。与半乳糖凝素3相似，通过敲除丝裂原活化蛋白激酶途径中的半乳糖凝集素1，可抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭特性。这些发现证实了半乳糖凝集素1和3作为骨肉瘤生物标志物的作用，并且其表达水平可能与疾病的进展相关。

3 乳酸脱氢酶

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）可催化糖酵解途径中丙酮酸和乳酸的相互转化，是包括骨肉瘤在内的多种癌症预后的生物标志物。Chen等[17]的研究表明，血清高LDH水平与骨肉瘤患者总生存率较低有关。Li等[18]研究发现乳酸脱氢酶B亚基（LDHB）在胚胎干细胞系中高度表达。相反，敲除LDHB导致这些细胞系的增殖、迁移和侵袭减少。与无远处转移的患者相比，在有远处转移、复发或晚期的骨肉瘤患者骨组织中检测到更高水平的LDHB基因。这些结果表明，LDHB有可能作为骨肉瘤的一个预后指标。

4 Ezrin蛋白

Ezrin属于（ezrin/radixin/moesin，ERM）蛋白家族，起连接质膜和细胞骨架的作用，在组织细胞表面结构黏附、迁移中起重要作用。多项研究表明Ezrin的表达与肿瘤转移有关。在骨肉瘤中，Ezrin的表达与肺转移有关，抑制Ezrin可减少肺转移的发生。Park等[19]的研究发现所有低分化肿瘤患者都存在Ezrin高表达。Li等[20]分析发现Ezrin的表达与骨肉瘤的复发和存活率低相关。表明Ezrin可能是骨肉瘤患者预后的有效标志。

5 其他蛋白标记

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1（APE1）是另一种可能用于预后的生物标志物，参与DNA碱基切除修复途径，在细胞凋亡和细胞周期中起作用，并调节其他转录因子（如HIF、NF-κB和p53）的表达。研究发现APE1的高表达与骨肉瘤患者生存期的缩短相关。

缺氧也可导致环氧合酶-2（COX-2）表达的激活。已有研究表明COX-2过表达促进了骨肉瘤的发生。此外，COX-2的表达与骨肉瘤患者的疾病特异性生存率呈负相关。COX-2抑制剂塞来昔布可以抑制细胞增殖并诱导人骨肉瘤细胞凋亡，这进一步证实了COX-2在骨肉瘤中的作用。一项Meta分析收集了来自14项研究的765例患者，分析了COX-2与肿瘤转移、临床分期和3年总生存率之间的关系，结果发现COX-2的高表达与肿瘤转移及临床晚期相关，提示COX-2可能是骨肉瘤的备选生物标志物[21]。Chen等[22]的一项研究证实了化疗前经病理活检后HIF-1、APE1、VEGF和COX-2蛋白表达之间的关系，并确定其预后价值。有研究通过免疫组织化学检测发现HIF细胞与COX-2、VEGF和APE1相关。

Src蛋白也属于在骨肉瘤发展和进展中有前景的生物标志物。骨肉瘤中，Src蛋白通过多种信号途径被激活成为磷酸化Src，在不同的细胞过程（如细胞存活、黏附和迁移）中发挥重要作用。Hu等[23]研究了Src在骨肉瘤患者中的表达，发现Src过度表达与骨肉瘤肺转移有关，并表明预后不良。Urciuoli等[24]发现了Src细胞定位在确定骨肉瘤预后中的重要性，强细胞核染色预示着预后良好，而强细胞质染色与预后不良相关。

Skoda等[25]研究发现Hedgehog蛋白可以调节骨肉瘤的进展，并影响骨肉瘤的远处转移。Lo等[26]研究表明，高水平的Hedgehog信号传导与高级别骨肉瘤的进展相关。关于Hedgehog信号传导的治疗潜力也有报道，例如，Hedgehog/Gli途径抑制剂可以防止骨肉瘤的生成[27]。因此，抑制Hedgehog途径可能是治疗骨肉瘤的新途径。

综上所述，目前许多基础、转化和临床研究已经报道了与骨肉瘤相关的生物标志物。基于这些研究，各种生物标志物可能被用于监测骨肉瘤的进展或预后。然而，目前很少有标志物能够作为疾病早期确诊指标。要成功地将生物标志物应用于临床，还需要更多随机对照临床研究。

参考文献

[1] Mirabello L，Troisi R J，Savage S A.Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004[J].Cancer，2009，115（7）：1531-1543.

[2] Bielack S S，Kempf-Bielack B，Delling G，et al.Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk： an analysis of 1，702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols[J].J Clin Oncol，2002，20（12）：2910-2911.

[3] Won K Y，Kim Y W，Kim H S，et al.MicroRNA-199b-5p is involved in the Notch signaling pathway in osteosarcoma[J].Hum Pathol，2013，44（8）：1648-1655.

[4] Cai H，Zhao H，Tang J，et al.Serum miR-195 is a diagnostic and prognostic marker for osteosarcoma[J].The Journal of Surgical Research，2015，194（2）：505-510.

[5] Zhou G，Lu M，Chen J，et al.Identification of miR-199a-5p in serum as noninvasive biomarkers for detecting and monitoring osteosarcoma[J].Tumour Biol，2015，36（11）：8845-8852.

[6] Ouyang L，Liu P，Yang S，et al.A three-plasma miRNA signature serves as novel biomarkers for osteosarcoma[J].Med Oncol，2013，30（1）：340.

[7] Lamora A，Talbot J，Bougras G，et al.Overexpression of Smad7 Blocks Primary Tumor Growth and Lung Metastasis Development in Osteosarcoma[J].Clin Cancer Res，2014，20（19）：5097-5112.

[8] Tu B，Peng Z X，Fan Q M，et al.Osteosarcoma cells promote the production of pro-tumor cytokines in mesenchymal stem cells by inhibiting their osteogenic differentiation through the TGF-β/Smad2/3 pathway[J].Exp Cell Res，2014，320（1）：164-173.

[9] Zhu Z Q，Tang J S，Gang D，et al.Antibody microarray profiling of osteosarcoma cell serum for identifying potential biomarkers[J].Mol Med Rep，2015，12（1）：1157-1162.

[10] Bing T，Du L，Fan Q M，et al.STAT3 activation by IL-6 from mesenchymal stem cells promotes the proliferation and metastasis of osteosarcoma[J].Cancer Lett，2012，325（1）：80-88.

[11] Hu T，Yang Q Xu J，et al.Role of β-isomerized C-terminal telopeptides （β-CTx） and total procollagen type 1 amino-terminal propeptide （tP1NP） as osteosarcoma biomarkers[J].Int J Clin Exp Med，2015，8（1）：890-896.

[12] Shang Y，Li Z，Li H，et al.TIM-3 expression in human osteosarcoma： Correlation with the expression of epithelial-mesenchymal transition-specific biomarkers[J].Oncol Lett，2013，6（2）：490-494.

[13] Li H，Zhang K，Liu L H，et al.A systematic review of matrix metalloproteinase 9 as a biomarker of survival in patients with osteosarcoma[J].Tumor Biology，2014，35（6）：5487-5491.

[14] Zhou X，Jing J，Peng J，et al.Expression and clinical significance of galectin-3 in osteosarcoma[J].Gene，2014，546（2）：403-407.

[15] Lei P，He H，Hu Y，et al.Small interfering RNA-induced silencing of galectin-3 inhibits the malignant phenotypes of osteosarcoma in vitro[J].Mol Med Rep，2015，12（4）：6316-6322.

[16] Park G，Kim D J，Kim Y S，et al.Silencing of galectin-3 represses osteosarcoma cell migration and invasion through inhibition of FAK/Src/Lyn activation and β-catenin expression and increases susceptibility to chemotherapeutic agents[J].Int J Oncol，2015，46（1）：185-194.

[17] Chen J，Sun M X，Hua Y Q，et al.Prognostic significance of serum lactate dehydrogenase level in osteosarcoma： A meta-analysis[J].J Cancer Res Clin Oncol，2014，140（7）：1205-1210.

[18] Li C，Chen Y，Bai P，et al.LDHB may be a significant predictor of poor prognosis in osteosarcoma[J].Am J Transl Res，2016，8（11）：4831-4843.

[19] Park H R，Cabrini R L，Araujo E S，et al.Expression of Ezrin and Metastatic Tumor Antigen in Osteosarcomas of the Jaw[J].Tumori，2010，95（1）：81-86.

[20] Li H，Min D，Hui Z，et al.The Prognostic Role of Ezrin Immunoexpression in Osteosarcoma： A Meta-Analysis of Published Data[J/OL].PLoS One，2013，8（6）：e64513.

[21] Jiao G，Ren T，Lu Q，et al.Prognostic significance of cyclooxygenase-2 in osteosarcoma： a meta-analysis[J].Tumor Biology，2013，34（5）：2489-2495.

[22] Chen Y，Yang Y，Yuan Z，et al.Predicting chemosensitivity in osteosarcoma prior tochemotherapy： An investigational study of biomarkers with immunohistochemistry[J].Oncol Lett，2012，3（5）：1011-1016.

[23] Hu C，Deng Z，Zhang Y，et al.The Prognostic Significance of Src and p-Src Expression in Patients with Osteosarcoma[J].Med Sci Monit，2015，21：638-645.

[24] Urciuoli E，Coletta I，Rizzuto E，et al.Src nuclear localization and its prognostic relevance in human osteosarcoma[J].J Cell Physiol，2018，233（2）：1658-1670.

[25] Skoda A M，Simovic D，Karin V，et al.The role of the Hedgehog signaling pathway in cancer： A comprehensive review[J].Bosn J Basic Med Sci，2018，18（1）：8-20.

[26] Lo W W，Pinnaduwage D，Gokgoz N，et al.Aberrant Hedgehog Signaling and Clinical Outcome in Osteosarcoma[J].Sarcoma，2014，2014：261804.

[27] Yao Z，Han L，Chen Y，et al.Hedgehog signalling in the tumourigenesis and metastasis of osteosarcoma， and its potential value in the clinical therapy of osteosarcoma[J].Cell Death Dis，2018，9（6）：701.

（收稿日期：2021-01-07） （本文编辑：姬思雨）