房亚梦,范欣悦,孔彤彤
(曲阜师范大学 生命科学学院, 山东 曲阜 273165)
拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)为梭子蟹科、青蟹属,是一种重要的经济养殖蟹类,广泛分布于中国和印度-西太平洋沿岸。然而随着海水养殖业的快速发展,与集约化水产养殖方式的出现,青蟹感染病原微生物的机率也大大增加[1]。呼肠孤病毒(Reovirus)、双顺反子病毒(Bicistronic virus)、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)等病毒感染引起的病毒性疾病是引起青蟹病害的重要原因,严重制约了青蟹养殖业的健康发展[2-3]。其中,WSSV是海洋动物常见的致病性病毒,可以感染绝大多数的海洋甲壳动物,给水产养殖业带来了严重的经济损失。已有报道指出野生和养殖的拟穴青蟹均可通过注射、喂养及病蟹(或虾)传染等多种途径感染WSSV[4-5]。但到目前为止,还没有明确防治WSSV感染的有效办法。
前列腺6跨膜上皮抗原4(six-transmembrane protein of prostate 4,STEAP4),属于STEAP家族,首先从小鼠的3T3-L1细胞中分离得到,可被肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α, TNF-α)诱导表达,因此也被称为肿瘤坏死因子α诱导蛋白(TNF-α induced adipose-related protein,TIARP)[6]。又因其与STAMP1基因的序列有高度相似性而被称为STAMP2[7]。STEAP4由六个跨膜α-螺旋以及细胞内亲水性的N末端和C末端组成[8]。N端包含一个与原核生物F420 相似的结构域,即NADP+氧化还原酶结构域;C端的跨膜结构域与酿酒酵母铁还原酶同源[9]。已有研究证明,STEAP4是一种金属还原酶,可以将细胞外Fe3+还原为Fe2+,Cu2+还原为Cu+,将电子从胞内的NADPH转移到细胞外的铁或铜,进而参与调控铁和铜的稳态,在细胞炎症应激的反应中发挥重要作用[10-11]。STEAP4参与调控代谢过程,并与代谢性疾病相关[12-13]。STEAP4在前列腺癌中上调表达,具有致癌作用,与结肠癌、肝癌和乳腺癌等癌症的发生相关[14-19]。除此之外,研究发现STEAP4抗体可抑制人脂肪细胞前体的增殖,促进其凋亡,说明STEAP4可能参与细胞增殖及凋亡途径[20]。
目前关于STEAP4的研究主要集中在哺乳动物,然而无脊椎动物STEAP4的研究极少。本研究克隆了STEAP4-like基因cDNA序列,对其进行生物信息学分析,利用qRT-PCR技术检测其组织分布情况,及其在WSSV感染后的表达应激情况,构建原核重组表达载体,并诱导表达与纯化重组蛋白GST-STEAP4-like,为解析STEAP4在无脊椎动物中的功能及探究拟穴青蟹抗WSSV免疫反应机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验动物:健康的拟穴青蟹购买自广东省汕头市牛田洋养殖场,将其暂养于盐度为 10‰的海水中,一周后用于后续实验。
主要试剂: Trizol购自 Invitrogen公司;DNA Marker、PrimeSTAR2Max DNA Polymerase购自宝日医生物技术(北京)有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、超薄DNA产物纯化试剂盒、EasyGeno单片段重组克隆试剂盒、FastKing cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)、FastKing 一步法反转录荧光定量试剂盒(SYBR Green)购自天根生化科技(北京)有限公司;pEASY®-Blunt Cloning Kit 购自北京全式金生物技术有限公司;ACD抗凝剂:NaCl 450 mM/L,葡萄糖100 mM/L, 柠檬酸25 mM/L,柠檬酸钠30 mM/L,加水至1 000 mL,调 pH值至 4.7。
实验引物见表1:
表1 实验所需引物
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取与cDNA的合成 首先抽取青蟹血淋巴于含有等体积ACD抗凝剂的RNase-free EP管中,4 ℃,600×g,离心10 min,收集血细胞。然后用Trizol试剂提取血细胞总RNA,并分别用琼脂糖凝胶电泳与Nanodrop 2000检测RNA的完整性及浓度。接着用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA 。
1.2.2STEAP4基因的克隆与鉴定 根据转录组数据库的已知序列,设计并合成STEAP4-like基因引物(S-F和S-R),进行PCR反应。PCR反应体系(25 μL):2×PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,cDNA模板1 μL,上下游引物各1 μL。反应程序:98 ℃ 10 s,54 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,35个循环。琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物,并切下目的条带,然后利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的DNA片段与pEASY®-Blunt载体25 ℃条件下,连接30 min后,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,使用引物M13-F和M13-R进行菌液PCR鉴定,将阳性克隆子并送至广州艾基生物技术有限公司测序。
1.2.3STEAP4-like基因的生物信息学分析 通过ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.Cgi)在线预测分析STEAP4-like基因的开放阅读框及氨基酸序列;利用National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和SMART software (http://smart.embl-heidelberg.de/)预测分析STEAP4或STEAP4-like蛋白的保守结构域;用ExPasy工具(https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白大小;用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对STEAP4-like氨基酸序列进行多序列比对,再用Jalview软件作图;使用MEGA5.2软件构建系统进化树。
1.2.4STEAP4-like基因组织特异性表达分析 分别取4只健康青蟹的血淋巴、鳃、肌肉、胃和内皮组织,血淋巴样品利用Trizol法提取血细胞RNA;其余组织于液氮速冻后,用fast 200组织总RNA极速抽提试剂盒提取其总RNA。用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测提取的总RNA的质量和浓度后,参照FastKing cDNA 第一链合成试剂盒(去基因组) 实验操作说明合成 cDNA。根据FastKing 一步法反转录荧光定量试剂盒(SYBR Green)说明书,配置反应体系:模板 2 μL,上游引物和下游引物各 0.8 μL,ddH2O 6.4 μL,2×FastReal qPCR PreMix 10 μL。qRT-PCR反应条件为:95 ℃预变性 30 s,40 个循环的 PCR 扩增( 95 ℃ 变性 5 s,60 ℃退火 30 s)。内参基因为β-actin。每个样品生物学重复3次,根据2-ΔΔCt算法,计算目的基因的相对表达量。
1.2.5STEAP4-like基因WSSV感染前后表达分析 将健康青蟹在实验室驯养一周后,给每只青蟹注射200 μL浓度为1×106copies/mL的WSSV混悬液。分别在注射0、12、24、48、72 h和96 h后抽取青蟹血淋巴,并离心收集血细胞沉淀用于提取RNA。再用qRT-PCR方法检测STEAP4-like基因在不同时间点的表达量。采用单因素方差分析(ANOVA)和t-test分析显着性差异,P<0.05为显着性差异,P<0.01为极显着性差异。
1.2.6STEAP4-like原核表达载体构建 用特异性引物r-F和r-R扩增STEAP4-likeORF全长(不含终止密码子),并回收目的片段(具体参照方法1.2.1);参照 TIANGEN 的质粒小提试剂盒说明书,提取pGEX-6p-1质粒,并用 EcoRⅠ和XhoI双酶切,37 ℃,3 h。参照 TIANGEN 超薄 DNA 产物纯化试剂盒说明书,回收酶切产物,用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测浓度后,利用EasyGeno单片段重组克隆试剂盒将其与目的DNA进行连接,50 ℃,20 min。将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用引物 pGEX5'和pGEX3'进行菌液PCR鉴定,将筛选阳性克隆子并送至广州艾基生物技术有限公司测序。
1.2.7 重组蛋白GST-STEAP4-like的诱导表达及纯化 将筛选得到的阳性单克隆子过夜活化后,按照1∶100的比例分别转接至三瓶含有氨苄青霉素的LB新鲜培养液中,37 ℃,180 r/min摇培3～4 h,待菌液OD 600 nm值为0.5左右时,取其中一瓶菌液 l mL作为未诱导对照组;另外两瓶加入 IPTG至其终浓度为 0.1 mM,分别置于16 ℃和37 ℃,140 rpm诱导培养 14 h和3 h。分别取5 mL菌液用于检测蛋白表达情况,4 ℃,6 000 r/min离心5 min收集细菌细胞沉淀。用含 0.1% Triton X-100的PBS重悬细菌沉淀,冰上间歇(破碎3 s,停5 s)超声破碎至菌液清亮后,4 ℃,13 000×g 离心 10 min,收集上清和沉淀。分别加入DTT、5× SDS-PAGE loading buffer(沉淀还需要加PBS)混匀后,95 ℃加热5 min,10 000 rpm离心后用于SDS-PAGE电泳。收集16 ℃,IPTG诱导培养的细菌细胞破碎上清液,参考全式金 ProteinIso GST Resin说明书纯化重组蛋白;并SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化情况。
2 结果与分析
2.1 STEAP4-like基因的克隆与二级结构预测分析
克隆得到拟穴青蟹STEAP4-like基因cDNA序列(GenBank号OQ658507),长1 495 bp,开放阅读框(ORF)长1 443 bp,编码480个氨基酸(图1)。预测拟穴青蟹STEAP4-like蛋白(Sp-STEAP4-like)大小为52.6 kDa,Sp-STEAP4-like蛋白 N端含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)结合位点(图2)。Sp-STEAP4-like和美洲螯龙虾STEAP4-like蛋白(Ha-STEAP4-like)N端都含有一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)氧化还原酶辅酶结构域,C端均含有一个铁还原酶跨膜结构域,而Pv-STEAP4-like仅N端有一个NADP氧化还原酶辅酶结构域(图3)。
注:方框为NADP氧化还原酶辅酶结构域;直线为铁还原酶跨膜结构域;圆圈区域为NAD结合位点;*为终止密码子
注:方框为NAD结合位点
注:美洲螯龙虾STEAP4-like(Ha-STEAP4-like: XP_042212141.1);南美白对虾STEAP4-like(Pv-STEAP4-like: XP_027210822.1); Homarus americanus STEAP4-like (Ha-STEAP4-like: XP_042212141.1); Penaeus vannamei STEAP4-like(Pv-STEAP4-like: XP_027210822.1)
2.2 STEAP4-like同源性及系统进化树分析
将STEAP4-like蛋白的氨基酸序列与NCBI数据库中其他物种的氨基酸序列进行同源性比对,发现其与三疣梭子蟹(Portunutusstritubercula)相似性最高,为86.46%,其余相似性在40%～60%之间(图4)。系统进化树结果表明,拟穴青蟹STEAP4-like与三疣梭子蟹和突眼蟹(Chionoecetesopilio)聚为一支,亲缘关系最为接近(图5)。具体物种信息见表2。
注:方框为NAD结合位点
注:用 Neighbor-Joining trees 方法构建拟穴青蟹STEAP4-like氨基酸序列系统进化树,结果用 1000 bootstraps检测其重复性;拟穴青蟹STEAP4-like用五角星标出
表2 氨基酸多序列比对与系统进化树中其余物种信息
2.3 STEAP4-like基因的组织分布
利用qRT-PCR 技术检测STEAP4-like基因在拟穴青蟹各组织中的表达情况,并以STEAP4-like基因在血淋巴中的表达量为参照。检测结果表明,STEAP4-like基因在所检测的各组织中均有表达,其中在肌肉中表达量最高,其次在胃、鳃中的表达量较高,在内皮中的表达量最低(图6)。
图6 STEAP4-like组织分布
2.4 WSSV感染拟穴青蟹后STEAP4-like的表达
本实验通过qRT-PCR 技术检测STEAP4-like在注射WSSV后不同时间点的表达情况。结果表明在 WSSV 刺激后 0、12、24、48、72 h和96 h, 青蟹血细胞中的STEAP4-like基因显着性下调表达(图7)。
图7 WSSV感染后STEAP4-like的表达
2.5 STEAP4-like重组蛋白的原核表达及纯化
SDS-PAGE检测结果显示,在70 kDa左右处有较浓条带,大小符合预期。表明经IPTG诱导后,重组蛋白GST-STEAP4-like可在上清液中表达,即可溶性表达,且在16 ℃,过夜诱导条件下表达量较高(图8 A)。收集16 ℃诱导的细菌细胞,经超声破碎后离心,取上清液,并用GST-resin纯化GST-STEAP4-like蛋白。结果如图8 B所示,纯化后在70 kDa左右处有GST-STEAP4-like蛋白条带,且条带较为单一,浓度较高,表明蛋白纯化成功。
注:图A GST-STEAP4-like诱导表达。M:预染蛋白 marker; 1:未诱导的上清蛋白;2:16 ℃诱导后的上清蛋白;3:37 ℃诱导后菌液的上清蛋白;图B GST-STEAP4-like的纯化。M:预染蛋白 marker;1:16 ℃诱导的上清蛋白;2和3:纯化后的GST-STEAP4-like蛋白
3 讨论
STEAP4可调控铁和铜的稳态,与细胞炎症应激反应、代谢性疾病与前列腺癌、结肠癌等多种癌症的发生有关[10,11,13,16]。本研究克隆了拟穴青蟹STEAP4-like(Sp-STEAP4-like)cDNA序列,其ORF长1 443 bp,编码 480个氨基酸,预测蛋白大小为52.6 kDa,共有9个NAD结合位点(G62、S63、G64、F66、G84、S85、R86、A18、V19),第60—142位氨基酸和第292—412位氨基酸有与美洲螯龙虾相似的NADP氧化还原酶辅酶和铁还原酶结构域。通过氨基酸多序列比对,发现Sp-STEAP4-like与三疣梭子蟹STEAP4-like相似性最高,为86.46%。系统进化树结果表明,拟穴青蟹STEAP4-like与三疣梭子蟹和突眼蟹聚为一支,亲缘关系最为接近。
在哺乳动物中,STEAP4基因主要在脂肪组织、胎盘、骨髓、肺、胰腺和心脏中表达, 参与代谢过程并与代谢性疾病相关,与前列腺癌、结肠癌等多种癌症的发生有关,而且STEAP4在细胞存活、增殖和凋亡中也起着重要作用[20]。本研究应用qRT-PCR 技术对STEAP4-like基因在拟穴青蟹各组织中的表达量进行检测分析,结果显示STEAP4-like基因在胃、内皮、肌肉、血淋巴和鳃组织中均有表达,且在肌肉中表达量最高,在内皮中的表达量最低。基因在组织中的特异性表达大多与其功能密切相关,而拟穴青蟹STEAP4的生物学功能有待进一步探究。
关于水生动物STEAP4的功能研究极为匮乏,仅有少数研究表明,STEAP4通过调节铁的含量,影响赛内加尔鳎的免疫能力[21]。在微囊藻毒素刺激下,鲢STEAP4的表达水平显着性上调,STEAP4可能在鱼类的炎症反应、代谢反应和系统动态平衡中发挥重要作用[22]。WSSV是虾蟹养殖产业中常见的致病性病毒,致病性强,致死率高[3,23]。本研究发现WSSV感染拟穴青蟹后,STEAP4-like基因显着性下调表达,说明STEAP4-like基因可能参与调控拟穴青蟹抗WSSV感染免疫反应。而此结果与鲢在微囊藻毒素刺激后STEAP4显着性上调表达相反,说明脊椎动物与无脊椎动物STEAP4-like功能可能存在差异性,且需要进一步的研究。除此之外,本实验构建了pGEX-6P-1-STEAP4-like重组表达载体,表达并纯化了重组蛋白GST-STEAP4-like,为制备多克隆抗体与探究互作蛋白等后续研究奠定基础。
4 结论
综上,本研究首次克隆了拟穴青蟹的STEAP4-like基因,检测分析了STEAP4-like基因在拟穴青蟹各组织中的表达量,其在各组织中均有表达,且在肌肉中表达量最高。WSSV感染青蟹后,STEAP4-like显着性下调表达。表明STEAP4-like基因可能参与调控拟穴青蟹抗WSSV感染免疫反应。构建原核重组表达载体,表达并纯化了重组蛋白GST-STEAP4-like。研究结果为探究无脊椎动物STEAP4-like功能及进一步了解拟穴青蟹抗WSSV的免疫反应机制奠定基础。
