崔健，杨明娟
（1.山东省临朐县检验检测中心，山东 潍坊 262600；2山东省临朐县畜牧局，山东 潍坊 262600）
传染性喉气管炎病毒疫苗的研究进展
崔健1，杨明娟2
（1.山东省临朐县检验检测中心，山东 潍坊 262600；2山东省临朐县畜牧局，山东 潍坊 262600）
传染性喉气管炎 (infectious laryngotracheitis，ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的一种急性接触性呼吸道鸡的传染病(朱旭东等[1]2005)，该病毒属于疱疹病毒科，A型疱疹病毒属，与疱疹病毒非常相似。该病第一次发生是1925年在美国的洛岛，该病主要导致鸡的死亡和产蛋量下降，目前已蔓延至全球各地，给养鸡业造成很大的损失。
近年来，各国对畜禽的一些严重疫病采取了以消灭疫源为根本目的的检疫-扑杀措施，但是还有许多动物传染病仍依赖免疫接种作为主要的预防措施，例如传染性喉气管炎。目前，用于防治该病的疫苗多为常规疫苗，但是其往往存在诸多不足。为了解决这些问题和保障畜禽养殖业健康发展，基因工程疫苗的研制越来越受关注。动物疫苗通常包括常规疫苗(灭活苗、弱毒苗)和基因工程疫苗(亚单位疫苗、基因疫苗、基因缺失疫苗、重组病毒活载体疫苗)袁子国[2](2008)。
1 常规ILTV疫苗
1.1 灭活疫苗 灭活疫苗制作方法简单易行，使用安全又不受雏鸡母源抗体的干扰。灭活苗制作原料复杂，又因其在免疫对象体内不能复制，免疫需要的抗原量较大，必须采用注射免疫，使用成本较高，产生的免疫抗体在血清中维持的时间短暂。因用ILT灭活疫苗的免疫效果不够好)，实际生产中预防ILT一般不使用。
1.2 弱毒疫苗 弱毒疫苗一般是将强毒株经人工致弱而成。目前，该种类疫苗在畜禽养殖中应用最多。该疫苗优点是：弱毒疫苗所用毒株的毒力虽已弱化，但仍保持着原有毒株的抗原性，能在体内繁殖但不引起发病；因而，免疫接种用量少，却可产生足够强的免疫力，免疫保护期长；该苗制作过程不需要加入佐剂，生产成本低，且动物产品(如肉类)的品质无影响；接种时可以采用口服或点眼等方法接种，使用方便、人工成本低，适合用作家禽等大数量动物的免疫接种。缺点是：在研究和使用中，存在着减毒程度无法精确控制、使用时毒力可能返强等问题。有案例证明弱毒疫苗能够返强成为可导致动物发病的强毒型，孙照刚等[3](2006)这也是该病无法有效控制的一个重要原因。因此，促使研制出毒力稳定的弱毒苗成为面临的首要课题。但是，ILTV只能在鸡胚和原代细胞中正常复制，没有发现有效的体外培养载体，致使没有开发出新的弱毒疫苗。
2 基因工程ILTV疫苗
2.1 亚单位疫苗 杨海生等[4]（2009）亚单位疫苗是利用基因工程手段制备病原体的亚单位成分，只含有病原体的部分结构，接种后不会在动物细胞内繁殖所以也就不会感染动物导致发病，安全可靠。目前，对该病亚单位疫苗的研究主要集中在病毒糖蛋白上，因为这些蛋白分子可引起体液和细胞介导的免疫反应。用提纯的ILTV GB基因编码的205kb糖蛋白复合物给鸡做免疫注射，达到100%保护率。这是因为该蛋白是ILTV的主要免疫原，是一种跨膜蛋白，在病毒粒子囊膜的外层上，在病毒感染和进入机体细胞的过程中起关键作用，能诱导细胞免疫和体液免疫。这种疫苗虽有相当的保护力，但其产品很难保持天然免疫原的立体结构，使其免疫效果与常规疫苗相比差距还比较大。
2.2 基因缺失疫苗 利用基因工程技术去除病毒复制非必需的与毒力相关的基因，是基因工程疫苗研究开发的热点领域，具有良好的应用前景。“猪伪狂犬病毒TK基因缺失疫苗”是第一个获得美国FDA批准的投入实际应用的基因工程苗，为ILTV基因缺失疫苗的研制提供了有力的参考。研究证明，TK基因是ILTV复制非必需基因，其缺失后毒力降低，使用安全性提高，但在生产中还未大面积应用。由于ILTV基因缺失苗克服了弱毒疫苗毒力偏强、接种后机体反应强等缺点，具有毒株不易返强复制能力未明显降低、免疫原性和安全性良好的优点。另外，ILTV野毒株在鸡体内产生胸苷激酶，而免疫动物不产生该酶，据此就能将自然感染的鸡和免疫的鸡区分开，因此TK基因缺失苗可作为标记疫苗使用(智海东等[5]，2000)。该疫苗的应用将为净化动物种群、消灭某些传染病带来可能。
2.3 重组病毒活载体疫苗 孙照刚等[3](2006)ILTV的活载体疫苗主要有两种方式：一是把ILTV的主要抗原基因插入到其它合适的活载体病毒中，如将GB基因等插入鸡痘病毒中的重组疫苗(王云峰等[6]，2004)；二是以致病基因缺失的ILTV当做活载体，通过插入表达外源抗原基因构建二价或多价疫苗。ILTV因其基因组中非必需的外源基因含量多，从而具备制备多价疫苗的活载体的条件。下面重点介绍ILTV作为活载体进行基因同源重组而插入外源基因作为多价疫苗的研究进展。
2.3.1 UL50(dUTPase)基因 该基因在动物自身细胞中普遍存在，缺失其的ILTV会借助分裂期细胞中的dUTPase仍可进行复制。孙照刚等[3](2006)第一次证实ILTV UL50基因不是毒力相关基因和病毒复制必需基因。将AIV HA H5基因片段插入UL50区造成了缺失，并以HCMV IE为启动子进行了表达。实验还发现，这些基因插入方向的不同对HA基因的表达无影响。使用表达H5的缺失UL50的ILTV接种鸡后，于康震等[7]（2001）能从这些鸡体内检测出抗ILTV和AIV HA的抗体，但滴度较低。这些鸡可以抵抗强AIV毒株和ILTV毒株的攻击。
2.3.2 ICP4孙照刚等[3](2006)同源基因 把B-gal标记基因插入其基因中，经传代5次后，经验证该外源标识基因能够稳定的传给下一代，也就是得到了重组体病毒。重组体病毒与野毒相比噬斑外观有所不同，周围形成较少的多核体细胞。
2.3.3 gM基因(UL10) 各种疱疹病毒中UL10基因功能各有不同。对ILTVDNA中UL10实施了缺失，孙照刚等[3](2006)仍然能表达GFP蛋白。从而证明ILTV在细胞内的复制，UL10基因是非必需的。
2.3.4 UL22下游ORFA-E基因 研究证明，孙照刚等[3](2006)UL22下游ORFA-E基因在细胞中复制对ILTV来说是非必需的，但也可以正常表达。分别在这些基因中插入了GFP基因和表达它们所需的元件，得到了5个重组的病毒。它们能在鸡肾细胞(CEK)中体外培养时成功复制，孙照刚等[3](2006)但是它们只在鸡肝癌细胞(LMH)上生长复制时产生噬斑，但与其亲本不同的是噬斑较小、滴度较低。其中，形成噬斑的能力缺失ORF-C基因的最小，缺失ORF-B的与亲体毒株差别不大。
2.3.5 UL0基因 孙照刚等[3](2006)在UL0位点插入两个抗原基因EGFP和AIV的HA(H7)，再分两组进行对比：一组是带FGFP和HA(H7)的缺失UL0的ILTV重组子，另一组是不带外源基因的。结果是：缺失UL0的ILTV重组子在细胞体外培养中的复制与其亲本株基本相同；另一组缺失UL0的EGFP或HA(H7)重组子的复制能力降低，在LMH细胞中形成的噬斑显着比其亲本株小；表达AIV HA的缺失UL0的ILTV和只缺失UL0的重组ILTV毒力均降低，被接种鸡临床症状不明显，在康复鸡体内不易检测到病毒。被接种鸡能抵御ILTV强毒和致死性H7亚型AIV攻击。以上说明，在重组ILTV UL0位点插入表达AIV的HA抗原基因能制作抗ILTV和AIV的二联活病毒疫苗。
2.3.6 UL23(TK)基因 张馨月等[8](2007)在TK基因内部插入B-gal基因，利用TK基因启动子，在与ILTV共同感染细胞时，发现这部分外源基因表达明显加强。李义平[9](2004)利用SV40启动子表达大肠埃希氏菌B-gal基因，重组后获得了缺失TK基因的ILTV。实验证实，在缺失TK基因的情况下ILTV仍能正常复制，且其复制能力与亲代株差不多，并预测ILTV能作为活载体使用。在ILTV中插入了B-gal基因、TK基因缺失，利用猪伪狂犬病毒gX基因启动子，孙照刚等[3](2006)SV40多聚腺苷酸做尾巴进行表达。Han等用强、弱毒株为亲本株，分两组将GFP基因插入TK基因序列，获得两株缺失TK基因的ILTV，并分析和比较了其的毒力和免疫效果。结果显示，在细胞中的复制能力两株重组子与其亲本株相当，感染能力有所降低，都能使免疫鸡不受ILTV强毒感染。
2.3.7 UL44(gC)基因 孙照刚等[3](2006)构 建了两种质粒分别在SV40和CMV启动子作用下表达NeoR和B-gal基因，它们的两臂都由ILTV gC基因构成。因此，发现gC基因有可能是在外源基因插入位点中较为能高效表达抗原蛋白的点为之一。因ILTV一般是经粘膜感染，更易刺激机体释放IgA抗体，用作病毒疫苗的活载体具相当的优越性。
2.4 基因疫苗 潘晓斌[10](2008)将编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因与含有真核启动子的质粒DNA连接后直接导入动物体内，在机体内表达相应的抗原蛋白，诱导机体免疫系统产生相应抗体的免疫保护作用。基因疫苗优点是：生产工艺简单、易于大量生产、造价低廉，不易变质、质量可控、免疫期长，运输和储存方便。其表达产物虽然分子量较小，但由于在宿主细胞内部，可刺激免疫系统即产生细胞免疫又产生体液免疫，免疫效果与弱毒活疫苗差不多，易于做成多联苗，发展前景良好。孟松树[11](2000)对预先接种了分别含有ILTV王岗株GB、GC、GD基因的重组空载体质粒及真核表达质粒分的鸡，进行攻毒试验。获得79%免疫保护率。结果表明，重组质粒刺激机体产生了免疫反应。因此，谢菲[12](2008)ILTV基因疫苗可以作为预防ILT的补充措施。在原种鸡场中，不用弱毒疫苗避免引起潜伏感染，再配合使用活病毒载体疫苗可能开辟出一条根除ILT的新途径。
3 结语
因弱毒疫苗可能引起的残留毒力潜伏感染及易返强等特点，使ILT的防治一度成为养禽业遭遇的重大困难。因基因疫苗比传统苗具有很多优势，王晓丽等[13](2008)随着分子生物学和基因工程的发展，使基因工程疫苗的研制日益受到重视。但是，国内ILTV基因疫苗的研究和报道较少，孙新峰[14](2008)与之研制有关的质粒、启动子、增强子、内含子和免疫佐剂等的选择，多个目的基因插入同一载体后是否互相干扰以及经不同方式接种后引起的免疫机理和效果等诸多问题还需进一步研究，基因工程疫苗真正投入应用的路还很长，但相信随着研究的深入，能够解决上述问题，从而设计研制出畜牧生产中急需的理想基因苗，消灭ILT甚至更多传染病成为可能。
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S858.312.4
A
1673-1085（2016）10-0051-04
2016-09-21
