山东省地方品系种鸡禽白血病净化技术的经验与探讨*

秦卓明，徐怀英，马秀丽，黄兵，李福伟，雷秋霞，李玉峰，曹顶国，逯岩，崔治中

（1.山东农业科学院家禽研究所，山东济南 250023；2.山东农业大学，山东泰安 271018）

秦卓明1，徐怀英1，马秀丽1，黄兵1，李福伟1，雷秋霞1，李玉峰1，曹顶国1，逯岩1，崔治中2

（1.山东农业科学院家禽研究所，山东济南 250023；2.山东农业大学，山东泰安 271018）

按照崔治中教授推荐的方案，对山东省农业科学院家禽研究所保存的优质地方品种鸡，分别进行了多年的禽白血病持续净化。禽白血病病毒p27病原携带率由净化前的平均50%以上，降低到目前的不足5%，部分品种的1日龄雏鸡胎粪检测已经连续三代ALV p27病原阳性率控制在0.3%以内，开产前的母鸡蛋清阳性率已连续2代低于1%，净化效果明显。该净化方案为我国地方品种鸡禽白血病的净化提供了一条技术可行的操作路径。

禽白血病病毒；地方品种鸡；净化

禽白血病（Avian leucosis virus，ALV）是由反转录病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称，具有血清型多（包括A、B、C、D和J亚型）、亚临床感染、垂直传播、感染率高等特点，既可诱发产生肿瘤，导致鸡群死亡，又可导致鸡群生长发育迟缓、免疫抑制等，并严重影响生产性能[1-2]。

经过世界禽白血病净化专家近20～30年的努力，目前国际上保留下来的不同品系的白羽肉用型种鸡或蛋用型种鸡群均已基本净化了不同亚群的家禽外源性白血病。但在我国，由于历史原因，我国自繁自养的地方品种鸡群大多都不同程度感染了经典的A或B亚群ALV，甚至感染了随白羽肉鸡由国外传入的J亚群ALV[3-4]。流行病学调查显示：部分纯地方品种鸡群对ALV-J的感染率已相当高，且已开始表现典型的髓细胞瘤和其他禽白血病的病理变化[3-5]。因此，适时开展地方品种鸡群ALV净化对于保障我国地方品种种子资源，防止禽白血病散播和流行意义重大。

山东省农业科学院家禽研究所为山东省地方鸡种子资源基因保存中心，拥有10多个优秀的家禽地方品种资源。为提高种子资源健康和保障后代雏鸡质量，提高地方品种的生长和繁育性能，我们对保存的部分地方品种鸡进行了禽白血病初步净化，并对其中的4个品种进行了重点净化。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂禽白血病p27抗原ELISA检测试剂盒、AB/J亚型抗体ELISA诊断试剂盒，均购自美国IDEXX公司；农业部哈尔滨兽医研究所研制的禽白血病P27抗原ELISA检测试剂盒（高玉龙研究员惠赠，在此表示感谢）。

1.1.2 细胞系 DF-1细胞系，山东农业大学赵鹏博士惠赠，由山东省农业科学院家禽研究所保存。

1.2 样品采集对不同品种母鸡的泄殖腔棉拭子、蛋清及公鸡的精液以及1日龄雏鸡胎粪分别进行了p27抗原检测。

1.3 地方品种核心群外源性ALV净化的程序从2008年以来，我们就陆续开始按照崔治中教授的建议进行白血病净化[6]。程序如下：

1.3.1 开产初期（23～25周龄）检测和淘汰初产期往往是鸡群禽白血病病毒排毒高峰期，开产前公、母鸡全部带翅号，每个刚开产母鸡连续3枚蛋的蛋清用ALV p27抗原ELISA检测试剂盒做p27抗原检测，淘汰阳性鸡。公鸡可采集精液检测p27抗原，淘汰阳性鸡。鉴于部分鸡品种的精液p27假阳性率太高，可对其血浆做病毒分离，以病毒分离的结果为准。对每只后备种鸡分别采集血浆接种DF-1细胞分离病毒，培养9d后用ALV p27抗原ELISA检测试剂盒逐孔检测细胞，淘汰阳性种鸡。如果后备种鸡是小群饲养，同一小群中如有一只为阳性，淘汰该小群所有鸡。

1.3.2 留种前（40～45周龄）检测和淘汰取样原则和检测方法同上，淘汰阳性种鸡同上。在感染严重的核心种鸡群，经过上一轮检测淘汰后，部分地方品系的种鸡在数量上可能不能满足遗传多样性的育种原则，但也要从严淘汰。作为补充，对于一些生物学性状确实优秀的个体，仍然可以保留，但必须与所有阴性鸡隔离饲养。从这些检测阳性的种鸡采集的种蛋再单独孵化，相应雏鸡按同样的净化程序单独隔离饲养，从由此长成的下一代育成鸡中仍可筛选出阴性鸡，然后再并入前一世代筛选出的同一品系阴性鸡群，以弥补地方品种鸡数量不足难题。本文中的芦花鸡即采用此方案。

1.3.3 种蛋的选留和孵化经上面两轮筛选后，选留的每只母鸡，应只跟选留公鸡群中的1只公鸡的精液授精，且按规定时间留足种蛋，每只母鸡所产的蛋均标上同一母鸡号，置入孵化箱时集中放置。在孵化18d后出壳前，将每只母鸡所产种蛋置于同一标号的专用灭菌纸袋中，再转到出雏箱中出雏袋（出雏袋厚度0.15mm，规格22×18cm，在雏鸡高度以上的位置，在纸袋的四周打出10～12个直径约1cm透气孔），所选雏鸡作为净化后的第一世代。本文未严格按照此方法命名，兼顾了常规育种的命名。

1.3.4 雏鸡1日龄胎粪检测出雏后，用棉拭子逐只采集1日龄雏鸡胎粪（每只操作完必须更换手套或彻底洗手消毒），置于小试管中。利用ALV抗原ELISA检测试剂盒检测胎粪p27抗原。要注意，同一只母鸡所产雏鸡中，有一只阳性即要淘汰同纸袋中的所有雏鸡，同时淘汰相应种鸡。

对选留的雏鸡，以母鸡为单位，同一母鸡的雏鸡放于一个笼中隔离饲养。每个笼间用纸板隔离，避免不同笼内雏鸡的直接接触及直接气流的对流造成ALV横向传播。

1.3.5 育雏6周龄后病毒血症检测育雏期结束，采鸡血浆，接种DF-1细胞分离病毒，培养9d后用ALV抗原ELISA检测试剂盒逐孔检测[7]，淘汰阳性后备鸡。对选留的后备种鸡，仍应维持小群隔离饲养，尽量使同一母鸡的后代置于一个小群中。

1.3.6 净化后第一世代留种鸡开产初期（约23～25周龄）检测和淘汰操作同1.3.1。

1.3.7 净化第一世代留种前（约40～45周龄左右）检测和淘汰操作同1.3.2。

1.3.8 第二世代鸡的检测和淘汰对经上述1.3.1到1.3.7步检测淘汰后种鸡的出壳雏鸡，作为净化后第二世代鸡。继续按1.3.4到1.3.7的程序，实施第二世代的检测和净化。第三世代以后，视净化的进展程度可按此程序继续循环进行，但应视净化的进展程度逐级调整。当全群不再检测出阳性或阳性率很低时，可酌情调整降低p27抗原ELISA反应中判定阳性的s/p阈值，即从严淘汰。

1.3.9 净化程序启动阶段的选择和维持以上程序代表一个世代的全部过程，这是一个循环过程。实施上述完整的对核心群鸡逐一检测和淘汰的程序，工作量很大、成本很高。根据国外成功的经验，当一个核心群连续3个世代都检测不出ALV感染鸡后，可转入维持期。在进入维持期后，就不需再对每只后备种鸡按上述做所有检测步骤，可改为对一定比例鸡的定期抽检。

1.3.10 借鉴SPF鸡生产管理经验对于净化后的鸡群，因其净化成本较高，因此，在管理时，应充分借鉴无特定病原鸡（SPF）管理规定隔离封闭饲养。

2 山东省地方品种鸡禽白血病病毒净化结果

2.1 山东省不同地方品种鸡禽白血病病毒净化结果

2.1.1 山东地方品种麻鸡3号（B3）净化的结果地方品种麻鸡3号（B3）为国家审定品系，目前已经连续净化7代，也是目前ALV净化最好的品种之一，详细结果见表1。由表1可见：母鸡连续在4～7世代留种或开产前蛋清p27阳性率在1%以下，初步达到国家有关种鸡场ALV净化的标准；公鸡精液的P27检测阳性率呈现显着降低趋势，6世代时下降到 1.92%（仍存在一定的非特异性），由于是精液或泄殖腔棉试子检测，尚不能排除其中的非特异性干扰，已多次对其阳性公鸡进行血浆病原分离，均未分到ALV；1日龄雏鸡2～4世代1日龄胎粪p27抗原阳性率为1.12%～4.32%，5～7世代胎粪阳性率均小于0.5%（图1）。

表1 地方品种B3禽白血病净化不同世代ALV p27抗原感染状况

图1 地方品种B3不同净化世代1日龄胎粪ALV p27抗原阳性率（%）

2.1.2 山东地方品种麻鸡1号（B1）净化结果地方品种麻鸡1号（B1）也是国家审定品系，目前净化已经进行5年，也是目前ALV净化最好的地方品种之一，详细结果见表2。由表2可知，母鸡已经连续在3～6世代留种或开产前蛋清p27阳性率在1%以下，初步达到国家有关种鸡场ALV净化的标准；公鸡精液的P27检测阳性率也呈现显着降低趋势，6世代时下降到5.15%，多次对阳性鸡进行病原分离，均未分到病毒（存在与上同样的问题）；雏鸡胎粪3世代1日龄胎粪p27抗原阳性率较高，为6.17%，4～6世代胎粪已降低到0.5%以下，净化效果明显（图2）。

表2 地方品种麻鸡1号（B1）禽白血病净化不同世代ALV p27抗原感染状况

图2 地方品种B1不同净化世代1日龄胎粪ALV p27抗原阳性率（%）

2.1.3 山东地方品种麻鸡2号（B2）净化结果山东地方品种麻鸡2号（B2）也是国家审定品种，目前已净化4个世代（详见表3）。由表3可知，母鸡开产前母鸡蛋清p27阳性率由2世代的1.86%降低至4世代的0.49%；公鸡p27阳性率由37.88%降至目前精液的2.68%；雏鸡4世代时1日龄胎粪阳性率降至0%，净化效果明显。

表3 山东地方品种麻鸡2号（B2）禽白血病不同净化世代p27抗原感染状况

2.1.4 山东芦花鸡净化结果芦花鸡是地方品种鸡中ALV污染较为严重的品种，净化前公鸡肛棉拭子p27抗原阳性率为57.95%，母鸡蛋清阳性率为37.63%。经3个完整世代的净化，取得了较好的净化效果，结果见表4。公鸡第三代精液p27抗原阳性率已下降至9.16%；母鸡蛋清中抗原阳性率下降到2.29%；雏鸡第4世代1日龄胎粪阳性率降至0.58%（第1世代为27.35%），净化效果显着（图3）。

表4 山东地方品种芦花鸡禽白血病净化不同世代ALV p27抗原感染状况

图3 地方品种芦花鸡不同净化世代1日龄胎粪ALV p27抗原阳性率（%）

2.2 山东省地方品种鸡禽白血病病毒抗体普查结果对净化后ALV p27抗原检测阴性的鸡（不同世代开产鸡）采集血清，进行了两次ALV不同亚群抗体的检测，结果见表5。

表5 山东省地方品种种鸡禽白血病血清学抗体阳性率（%）

由表5可见，鸡群ALV抗体阳性率的高低与病毒携带率不相关。除少数品种ALV-J有个别阳性外，大部分地方品种为阴性。值得警惕的是，几乎所有的地方品种鸡都不同程度地感染了ALV A/B亚群病毒，且抗体阳性的比率在逐年增高，这一点应引起高度关注并分析其内在原因，以便采取相应的对策。

2.3 山东省地方品种鸡总体禽白血病病毒净化结果在对上述4个品系重点净化的同时，我们对所内所保存的其他品系，也进行了同步净化，取得了初步的效果，汇总上面所净化的结果，一并总结，净化前后的比较结果见表6。

表6 山东省地方品种禽白血病净化前后ALV p27抗原阳性率（%）

鉴于部分地方品种的阳性率较高，为避免对其他已净化品种的传播，项目组忍痛割爱，进行淘汰。

3 讨论

3.1 对地方品种ALV净化程序和细节的建议禽ALV净化主要是对地方品种种鸡群进行彻底地净化。国际通用的惯例是采取至少5次以上的p27抗原检测进行筛选。对核心群鸡全部采用血浆接种DF-1细胞，培养9d后检测p27抗原，凡阳性者一律淘汰，且分别在68日龄和168日龄做二次采血检测，另外，对保留的核心鸡群的下一代进行1日龄胎粪检测，淘汰同一窝所有阳性鸡，如此反复。此法效果已得到有效证实，但技术要求较高、人力成本、试剂成本以及实验室条件都比较高，国内鸡场很难推广应用。

社会存在决定着社会关系，但存在多元化的价值观念并不意味着其具有合理性，“超女热”“相亲热”“考证热”“出国热”等现象需要引起重视。经济成分的多元化，必然会导致价值观念的多元化，所以不能简单地再以重集体轻个人为标准来评价青年的道德水平，而是以青年的价值观念是否与社会倡导的价值观念一致以及青年所持有的价值观念是否有利于社会发展为衡量标准。

崔治中教授自2005年就致力于国内鸡群ALV的净化，在总结大量实践经验的基础上，结合国内外ALV净化的经验，提出了我国鸡群ALV净化不同阶段所应采取的措施，取得了切实可行的实践效果。我所自2008年就在崔老师的指导下进行地方品种鸡的净化，积累了一系列成熟的经验，获得了一定的成功。在地方品种种禽群净化前，母鸡ALV抗原阳性率最高达60.33%，公鸡阳性率高达71.23%。部分品种如琅琊鸡因为ALV感染率过高，而挑不出阴性鸡群，不得不淘汰。剩余的鸡群均取得了可喜的结果。经过4年的持续净化，10个地方品种种鸡群的阳性率大大降低，其中4个品种的1日龄胎粪p27抗原阳性率降至0.5%以下，母鸡蛋清阳性率低于1%，已初步达到国家对种禽场禽白血病的净化要求。实践证明：崔老师建议的方案是可行的，且与国外相比，无论是财力还是人力，都适合中国国情。

除此之外，在ALV净化时，还要关注以下几个环节：①在世代净化前，对留种前对母鸡和公鸡进行检疫，每只留种公鸡精液对应固定的母鸡；②同一孵化室只用于一个地方品种来源种蛋的孵化，以预防在孵化室内早期的横向传播；③在孵化后期及1日龄雏鸡采用小型纸袋进行相对隔离，尽快进行胎粪检测淘汰阳性鸡，最大限度地缩短检测的时间，提高效率。雏鸡笼用挡板隔离，避免横向传播。

在净化的过程中，也出现了ALV感染p27抗原阳性率的反弹，大都发生在开始净化后的第3～4代，几乎成为定律。对其中的原因，我们仍在探索之中。

3.2 引进种鸡前必须做最严格的ALV检疫通过对我所地方品种鸡ALV净化前的临床检测，结合大量的临床样品ALV普查，证实目前我国的地方品种鸡大都污染有ALV，且主要是A/B亚群。事实上，早在1982年前，山东省农业科学院家禽研究所试图从我国地方品种中建立起净化的无特定病原鸡群，经过大约3年的努力，终因ALV感染率过高，且我国鸡群内源性白血病E亚群几乎100%感染，导致净化无果而终。最后，还是采取了从美国、德国和英国等引种的路子，缩短了我国SPF鸡培育成功的时间。当然，引种是获得家禽新品种的一条捷径。即便是国际上最优秀的大型育种公司，有时也要从其它来源引进特定的种鸡。但当需要从其他来源引进种鸡时，在引进鸡场前必须对其ALV做严格的检疫和检测，而且这种检疫绝不能仅是一次性的[8]。如前所述，鸡在感染ALV后的病毒血症或排毒是间隙性的，而且没有那一种方法能一次把鸡群中的感染和带毒鸡都能检测出来。所以，至少要检测到性成熟开始产蛋时。

实际上，1988年在英国发现ALV-J亚群以后的几年内，该病之所以能在短短几年内蔓延至全球各国几乎所有大型白羽肉鸡的育种公司的原种核心鸡群中，很显然，这些都与上述公司相互引种直接相关。一旦ALV-J亚群在一个鸡群中流行，便很快传播至其他公司的白羽肉鸡群。因为ALV-J主要通过种蛋垂直传播，而且潜伏期可长达6个月，普通1～2个月的隔离检查于事无补。1995年前后，为了培育我国自己的快大型黄羽肉鸡，缩短育种时间，部分公司在不了解禽ALV-J的危害性和传播途径的情况下，引进了国外白羽肉鸡作为种鸡资源，使之与不同的地方品种鸡杂交，从而在保留羽毛的黄色或杂色的同时，还能从白羽肉鸡的遗传性中获得长得大、生长快、料肉比低的优良特性。然而，正是这一过程，在不经意间把ALV-J带进了我们自己的核心鸡群，并在繁育扩大鸡群的过程中，使该病蔓延开来[9-10]，而且带来的经济损失越来越大，有时还在养殖企业间造成很大的经济纠纷。正因为如此，引进外来种鸡群时，必须做好对鸡群ALV的长期、系统的跟踪和监测。

3.3 需要特别关注的疫苗问题对选留鸡选用的所有活疫苗，必须经严格检测，确保绝对没有外源性ALV污染，这一点十分关键。除此之外，对灭活苗目前尚存争议。大多数灭活苗由于是“死”苗，很多人认为是比较安全。但是，我们知道，尽管灭活苗是经过“灭活”的抗原，但灭活不可能完全100%杀灭病毒，从生物学的角度上讲，只能是无限接近，少数的“漏网之鱼”是可能的。人们关注的仅是“本病毒”是否灭活完全，而忽视了鸡的垂直传播性病原，其中就包括禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒等。在实际的生产中，我们往往对每批弱毒活疫苗批批检测，而不注重灭活苗的质量检测。目前需要免疫的灭活苗包括：新城疫病毒、高致病性禽流感的不同亚型病毒（RE-4/RE-5/RE-6/RE-7/RE-8）、低致病性禽流感病毒、减蛋综合征病毒、传染性支气管炎的不同亚型病毒、病毒性关节炎病毒、禽脑脊髓炎病毒等的单苗、联苗不下十余种，其接种次数在20次左右。频繁的接种很难保证万无一失。事实上，在对鸡群的禽ALV抗体检测过程中，我们发现，鸡群的日龄愈长，其ALV的A/B亚群抗体阳性率愈高（见表6），而病毒分离又为阴性。鉴于ALV病毒与血清抗体复杂的关系：病毒阳性，抗体可能阴性；病毒阴性，抗体可能阳性；病毒与抗体均为阳性等，上述可能性均存在。这无疑对鸡群的ALV净化增加了难度。也是我们必须的思考所在。因此，进行ALV种源净化的鸡群，其接种的灭活苗制备原料鸡胚最好也要SPF化。

其次，由于ALV感染对年龄和感染途径有很强的依赖性，年龄越小越易感，注射感染比其他途径易感，所以应高度关注雏鸡阶段使用的疫苗。一要特别关注的是液氮保存的细胞结合性马立克氏病疫苗。该疫苗是在出壳后在孵化厅立即注射，而且如果发生污染，也容易污染较大的有效感染量（包括细胞内和细胞外）；其次是通过皮肤划刺接种的禽痘疫苗。当然，其他弱毒疫苗也要关注。但前面提到的二种疫苗，外源性ALV污染带来的危害最大。

需要强调的是：对于鸡群白血病净化来讲，其所应用的所有疫苗绝不能有ALV的污染。否则，一旦使用了被外源性和内源性ALV污染的疫苗，将使种鸡群重新感染ALV，净化取得的所有成果将化为泡影，务必慎之又慎。

3.4 禽白血病净化需要长期、持续的坚持和努力禽白血病的净化是一个系统工程，需要政府、公司和科研部门等多部门联动。政府应在政策方面（项目和资金等）予以持续支持，企业应成为ALV净化的主体，科研部门要做好保驾护航。行百里者半九十，禽白血病净化任重而道远。

[1]Y.M.Saif主编，苏敬良，高福，索勋，主译.禽病学[M].第12版.北京:中国农业出版社，2012.

[2]崔治中.我国鸡群中禽白血病流行现状和对策[J].中国家禽，2009(13):1-3.

[3]崔治中.我国不同品种鸡群中禽白血病的流行情况及诱发肿瘤的多样性[J].中国家禽，2010(19):40-42.

[4]秦卓明，仉伟，刘霞,等.疑有禽白血病病毒混合感染的肉种鸡大肝大脾病[J].家禽科学，2014(11):6-10.

[5]尹青，孙淑红，柴家前，等.百日鸡J-亚群禽白血病组织病理学与超微病理学研究[J].中国兽医学报，2012(02):290-295.

[6]崔治中.鸡白血病及其综合防控措施[J].兽医导刊，2010(11):26-29.

[7]秦卓明，徐怀英，马秀丽，等.从芦花鸡分离的J亚群ALV病毒及其gp85基因演化 [J].浙江农业学报，2014(05):1180-1185.

[8]崔治中.种鸡场禽白血病防控和净化技术方案[J].中国家禽，2015(23):1-7.

[9]刘绍琼，王波，张振杰，等.817肉杂鸡肉瘤组织分离出 A、J亚型禽白血病病毒 [J].畜牧兽医学报，2011(03):396-401.

[10]张胜斌，吴天威，韦平，等.地方优良鸡种禽白血病病毒感染调查及净化，[J].中国家禽，2010(12):11-16.

S858.31

1673-1085（2016）12-0003-09

2016-11-12

国家公益性（农业）行业科研专项（201203055）。