周俊立 叶小华 邹志辉等
摘要：目的 研究香鳞毛蕨醇提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的抑制作用， 初步探讨其抗真菌作用机制。方法 采用ELISA测定角鲨烯环氧化酶活性，还原糖法测定β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性。结果 香鳞毛蕨提取物不同浓度组均能降低红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性，差异有统计学意义（P<0.05），随香鳞毛蕨提取物浓度增加，红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性逐渐降低，香鳞毛蕨提取物中浓度组和高浓度组能降低β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性，差异有统计学意义（P=0.002，P=0.000）。结论 香鳞毛蕨提取物抗真菌作用机制可能和角鲨烯环氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性受到抑制有关。
关键词：香鳞毛蕨提取物；红色毛癣菌；角鲨烯环氧化酶；β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶
红色毛癣菌T. rubrum 是临床常见的皮肤癣菌， 也是浅部真菌病的主要病原菌，是一种在世界范围内广泛传播的病原真菌， 它能引起各种浅表感染， 如头癣、体癣、股癣、手癣、足癣以及甲癣。红色毛癣菌是一种专性致病菌，一旦感染红色毛癣菌则很难根治，在停用抗真菌药物后会经常复发[1]。
香鳞毛蕨（Dryopteris fragrans L.）为鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物，生长于海拔1000～1700m的山坡或岩石缝中，用于治疗真菌感染的手足癣、体股癣等，疗效甚佳，不易复发[2]。为了探讨香鳞毛蕨提取物抗皮肤癣菌的作用机制， 本实验研究了香鳞毛蕨提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的影响， 为研究香鳞毛蕨抗真菌作用原理提供实验依据。
1 材料
1.1药物 供试药材本实验研究所用的香鳞毛蕨采集于黑龙江省，经鉴定为鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物香鳞毛蕨，香鳞毛蕨提取物采用70% 醇提液，用二甲基亚砜（DMSO）配制成含生药浓度为625mg/ml的储存液， 存于-70℃冰箱备用。
1.2菌株 红色毛癣菌购自中国医学科学院皮肤病防治研究所菌种保藏中心。
1.3 主要试剂 真菌角鲨烯环氧化酶酶联免疫分析试剂盒；真菌细胞β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性定量检测试剂盒， 美国GENMED SCIENTIFICS INC 产品。
1.4主要仪器 生化培养箱（Forma 3111）， 美国赛默飞世尔科技产品；生物安全柜（Thermo Forma 1389），美国赛默飞世尔科技产品；高速低温离心机， 德国Eppendorf公司产品；酶标仪（Bio-Rad X mark）， 美国Bio-Rad公司产品；荧光光度计（Thermo Scientific Lumina）， 美国赛默飞世尔科技产品。
2 方法
2.1实验分组 分空白生长对照组和香鳞毛蕨提取物低、中、高浓度组（香鳞毛蕨70% 醇提液含生药浓度由低向高依次为62.5，125，250mg/ml）。实验方法参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）药物敏感性试验方案， 将不同浓度的香鳞毛蕨提取物和红色毛癣菌在25℃孵育7d，然后收集培养物菌丝样品用于酶活性测定。
2.2 ELISA测定角鲨烯环氧化酶活性 收集红色毛癣菌（空白对照组和香鳞毛蕨提取物低、中、高浓度组）培养液， 1000 g离心10 min，分离红色毛癣菌培养物菌丝，用pH 7. 0的PBS缓冲溶液漂洗3次，1000 g离心10 min，上清弃掉。每组称取培养物菌丝样品0.3g，加1 ml PBS缓冲溶液（pH 7. 0），超声破碎细胞，-20℃放置过夜，第2d反复冻融3次，然后5000g 离心5min，吸取上清，酶活性测定按照ELISA试剂盒说明书进行操作。每组重复实验3次，计算其酶活性平均值。
2.3β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性测定 本实验采用还原糖测定法（分光光度法）进行β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性测定。收集5 ml真菌细胞培养液，裂解后按试剂盒说明说进行操作。每组重复实验3次，计算其酶活性平均值。
2.4统计学分析 采用SPSS17.0数据处理软件，不同浓度组对酶活性的影响采用单因素方差（ANOVA）分析，组间两两比较采用LSD-t检验。
3 结果
3.1不同浓度香鳞毛蕨提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响 ANOVA分析，不同浓度组香鳞毛蕨提取物处理后红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性差异有统计学意义（F=39.403，P=0.000），表1结果表明，香鳞毛蕨提取物不同浓度组均能降低红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性（差异有统计学意义，P<0.05），不同浓度组香鳞毛蕨提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响两两比较差值均有统计学意义，且图1结果显示随香鳞毛蕨提取物浓度增加，红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性逐渐降低，香鳞毛蕨提取物高浓度组红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性最低。
3.2不同浓度香鳞毛蕨提取物对红色毛癣菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性 ANOVA分析，不同浓度组香鳞毛蕨提取物处理后红色毛癣菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性差异有统计学意义（F=14.521，p=0.001），不同浓度组香鳞毛蕨提取物对红色毛癣菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性的影响两两比较结果表明（表2），和对照组相比，香鳞毛蕨提取物低浓度组红色毛癣菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性差异无统计学意义（P=0.200），中浓度组和高浓度组差异有统计学意义（P=0.002，P=0.000）。
4 讨论
香鳞毛蕨是一种重要的药用植物，有研究发现，香鳞毛蕨具有显着的抗皮肤癣菌作用，逐渐地被人们重视[2]，但其抗真菌作用机制目前还不太明确。
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构成分，在确保膜结构的完整性、生物调节、细胞活力以及物质运输等方面起着重要作用[3]。目前临床最常用的抗真菌药物主要有两性霉素B、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和特比萘芬， 它们都是针对真菌细胞膜上的特有脂质麦角甾醇来发挥其抗真菌作用的[4]。角鲨烯环氧化酶是真菌细胞膜麦角甾醇生物合成通路中的一个重要酶， 它能使角鲨烯转变成羊毛甾醇。角鲨烯环氧化酶如受到抑制， 将导致真菌重要膜成分麦角甾醇生物合成受到抑制，真菌细胞发生损伤或死亡[5]。本实验研究结果显示，香鳞毛蕨提取物不同浓度组均能降低红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性（差异有统计学意义，P<0.05），随香鳞毛蕨提取物浓度增加，红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性逐渐降低，香鳞毛蕨提取物浓度高浓度组红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶的活性最低。提示香鳞毛蕨抗真菌机制可能是通过抑制角鲨烯环氧化酶的活性， 从而影响真菌细胞膜重要成分麦角甾醇的生物合成有一定的关系。
葡聚糖是细胞壁的主要成分， 占细胞干重的48% ～ 60%，β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性如受到抑制，就可致真菌细胞壁结构破坏， 细胞破裂死亡[6]。本实验研究结果显示香鳞毛蕨提取物可能对β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性有抑制作用，提示香鳞毛蕨提取物可能通过相应途径破坏真菌细胞壁起抗真菌作用。
综上所述，本实验通过研究香鳞毛蕨不同浓度的提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性的影响，结果提示香鳞毛蕨抗真菌机制可能是通过抑制角鲨烯环氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的活性， 影响真菌细胞膜重要成分麦角甾醇的生物合成有一定的关系。
参考文献：
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[2]沈志滨，金哲雄，张德连，等.香鳞毛蕨的生药学研究[J].中草药，2002，33（7）：661-663.
[3]古力娜.达吾提，斯拉甫.艾白，李治建，等.气-质联用研究地锦草提取物对红色毛癣菌麦角甾醇的影响[J].中国医院药学杂志，2010，30（12）.
[4]叶丽娟，王辂，朱辉.抗真菌药物作用机制及真菌耐药机制的研究进展[J].国外医药抗生素分册，2006，27（5）：221-227.
[5]赵明月，李治建，古力娜·达吾提， 等.地锦草有效部位对红色毛癣菌羊毛甾醇生物合成的影响[J].中药药理与临床，2012，28（ 3）：142-144.
[6]张影，王东，李兴从，等.抗病原真菌药物的研究进展[J].天然产物研究与开发，2011，23：983-991.编辑/刘小燕
