复方钙片中维生素D3的含量测定

苏欢欢+徐风华

摘要：目的 建立高效液相色谱法测定复方钙片中维生素D3的含量。方法 采用Venusil MPC18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相：甲醇；流速：1 ml/min；检测波长：265 nm；柱温：25℃；进样量：20 μl。结果 维生素D3在0.6～3.0 μg/ml的范围内有良好的线性关系，平均回收率为98.62%。结论 本实验建立的高效液相色谱法快速，简便，准确，可用于复方钙片中维生素D3的含量测定。关键词：维生素D3；高校液相色谱法；含量测定

维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。它可以帮助人体更好地吸收钙，增强骨骼韧性和密度，预防骨质疏松，此外还能预防很多慢性病像癌症，糖尿病，风湿性关节炎，多发性硬化，自体免疫等疾病[1-3]。人体所需钙量因年龄、生理及病理等不同而异。人们可以根据自己的需求适当补充维生素D和钙。维生素D3是维生素D家族中的重要成员。实验室前期制备了维生素D3和钙的复方制剂，为了控制该制剂中维生素D3的质量，建立了高效液相色谱法测定维生素D3的含量。

1仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ5200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RJ-TGL-16C台式高速离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）；复方钙片（本院自制）；维生素D3对照品（1000611-200607，中国药品生物制品检定所）；甲醇、乙醇均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Venusil MPC18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇；流速：1 ml/min；检测波长：265 nm；柱温：25℃；进样量：20 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取5 mg的维生素D3对照品置于250 ml的棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，使成为20 μg/ml的对照品溶液。精密吸取该对照品溶液3 ml置于50 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得1.2 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品20片放入研钵中研细成粉末，取粉末适量，精密称定后放入50 ml锥形瓶中，加入10ml乙醇，称重，浸润10 min后超声20 min，补足减失的重量。将溶液转移至离心管，放置离心机中以4000 r/min离心5 min。取离心后的上清溶液，作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照品溶液的制备 照复方钙片的制备工艺制备不含维生素D3的空白片，取该片适量放入研钵中研成粉末，以下操作同2.2.2项下供试品溶液的制备方法，制得阴性对照品溶液。

2.3系统适应性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20 μl，按2.1项下的色谱条件进样，记录色谱图，见图1。结果显示供试品溶液在与对照品溶液色谱图相应的位置上有相同保留时间的色谱峰，且被测成分与相邻杂质峰分离良好。

2.4线性关系考察 分别吸取20 μg/ml对照品溶液0.3 ml、0.5 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.5 ml至10 ml棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按2.1项下的色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标（Y），以对照品溶液的浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得维生素D3的回归方程为Y=66.16 X-1.910，r=0.9995。结果表明维生素D3在0.6～3.0μg/ml的范围内线性关系良好。

2.5精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果显示峰面积的RSD为0.50%，表明精密度良好。

2.6重复性试验 取同一样品，精密称取6份，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备成溶液，进样，结果显示峰面积的RSD为1.89%，表明重现性良好。

2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在棕色瓶中室温放置0 h、2 h、5 h、7 h、8 h后进样，测定峰面积。结果显示峰面积的RSD为0.64%。表明供试品溶液在8 h内有良好的稳定性。

2.8回收率实验 按处方比例称取原料药，将维生素D3分高、中、低三个剂量加入到空白辅料中。然后按供试品溶液的提取方法提取维生素D3计算回收率。结果平均回收率为98.62%，RSD为2.02%，见表1。

2.9样品含量测定将三批复合钙片进行研磨成粉，取适量精密称定，按供试品溶液的制备方法进行处理。平行操作三份，见表2。

3讨论

为了确定辅料是否影响维生素D3的吸收，本实验制备了不含维生素D3的阴性样品溶液，在265 nm波长下检测，进样后观察，在与对照品保留时间相同的位置无吸收峰出现，见图1 C。因此本实验选择265 nm作为测定波长，与历士旺等[4]选择波长不同。

依据参考文献[5]，本实验考察了甲醇：水（95：5）作为流动相时的色谱系统，出峰时间较长，后调节甲醇的比例，发现改用甲醇作为流动相时，在15 min以内出峰，且峰形较好。

本实验在实验过程中考察了提取溶剂（甲醇、乙醇、氯仿）、超声时间（10 min、15 min、20 min、30 min）、提取次数（一次、两次、三次）对维生素D3提取效率的影响，结果表明采用乙醇、超声时间20 min、提取次数为一次时维生素D3的峰面积达到最大值。

本实验建立的高效液相色谱法方法简便易行，重现性好，结果准确，可用于复合钙片中维生素D3的含量测定。

参考文献：

[1]时超玲，李社莉.维生素D及其类似物在1型糖尿病防治中的应用前景[J].医学综述，2014，20（11）：2028-2030.

[2]周静，王晋平，周孝德，等.骨化三醇在类风湿关节炎合并骨质疏松中的作用研究[J].中华临床医师杂志，2013，7（24）：116-119.

[3]Sarah Hewer，Robyn Lucas，Ingrid van der Mei，et al.Vitamin D and multiple sclerosis[J].Journal of Clinical Neuroscience，2013，20，634-641.

[4]历士旺，赵亚平，张亚锋，等.HPLC法测定钙-D颗粒中维生素D3的含量[J].西北药学杂志，2003，18（1）：3-4.

[5]邵耀东，赵小华，胡彬，等.利用酶解法测定复合维生素溶液中维生素D3含量的研究[J].畜牧与兽医，2012，44（1）：61-63.

编辑/申磊