刘毅 范鹏程 曾学民
摘 要：目的 监测四川省成都市三区县外环境中禽类流行性感冒（禽流感）病毒的分布状况，为人禽流感防控提供参考依据。方法 我中心在2017年5月～2018年5月采用实时荧光定量PCR检测成都市三区县外环境中甲型流感通用病毒，再将阳性标本进行H5、H7、N9和H9分型，采用χ2检验比较定性资料。结果 在497份样本中，甲型流感病毒阳性标本87份，检出率为17.91%；分型实验中，H5、H7、N9和H9分别检出7份、6份、12份和41份，其阳性检出率依次为1.41%、1.21%、2.41%、8.25%，未分型成功23份，占总样本的4.63%。结论 成都市三区县外环境存在禽流感病毒污染，有人感染禽流感风险；需加强对外环境及高危人群禽流感监测，并规范对市场的管理机制，落实消毒和检疫准入等预防措施。
关键词：禽流感；监测；外环境
中图分类号：R181.8；R511.7 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.17.036
文章编号：1006-1959（2018）17-0119-03
Abstract：Objective To monitor the distribution of avian influenza（avian influenza）virus in the external environment the three districts of Chengdu，Sichuan province，and provide reference for the prevention and control of human avian influenza.Methods From May 2017 to May 2018，our center used real-time fluorescent quantitative PCR to detect influenza A virus in the external environment of the three districts of Chengdu.The positive samples were classified into H5，H7，N9 and H9，qualitative data were compared using the χ2 test.Results Among the 497 samples，87 were positive for influenza A virus，and the detection rate was 17.91%.In the typing experiment，7，6，12 and 41 were detected for H5，H7，N9 and H9，respectively.The positive detection rate was 1.41%，1.21%，2.41%，and 8.25%，and 23 cases were untyped，accounting for 4.63% of the total sample.Conclusion There is avian influenza virus contamination in the external environment the three districts of Chengdu，and some people are infected with avian influenza.It is necessary to strengthen the monitoring of avian influenza in the external environment and high-risk population，and regulate the market management mechanism and implement preventive measures such as disinfection and quarantine access.
Key words：Avian influenza；Monitoring；External environment
禽类流行性感冒又称禽流感（avian influenza），是由甲型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类间的传染病，一般不会感染人，但由于病毒在复制时其RNA不稳定，易发生基因突变、重组，从而获得感染人的能力，导致人禽流感疾病的发生，近年来在人群中造成严重的公共健康的威胁[1，2]。根据病毒致病性强弱，分为高致病性、低致病性和非致病性三类，目前引起人禽流感主要为H5N1、H7N1、H7N9和H9N2等[3]。2016年成都市连续确诊1例人感染H5N1、1例重症肺炎感染H9N2，通过流行病学调查2例患者均有活禽市场暴露史[4，5]。为了解成都市三区县环境禽流感病毒的动态分布情况及其差异，科学开展预警预测工作，成华区疾控中心按照成都市疾控中心的要求，自2017年5月起，开展成华区、大邑县、崇州市三地的外环境禽流感监测。
1对象与方法
1.1监测点 根据《成都市H7N9禽流感环境监测方案》的要求，以及三地禽类养殖、活禽交易市场分布特点，2017年5月为基线监测，监测点位为活禽市场。之后监测点设置为活禽市场（尤其是活禽批发市场）、售卖禽类流动摊贩和自养禽家庭。
1.2监测时间及采样数量
1.2.1基线监测期 每个活禽市场采集3～5份环境综合涂抹样，标本应尽量覆盖多个摊位。
1.2.2流行期 为每年10月到次年4月。每个活禽市场采集1～3份环境综合涂抹样，采集售卖禽类流动摊贩3～5家（每家1个环境综合涂抹样），采集自养禽家庭3～5家（每家1个环境综合涂抹样）。
1.2.3非流行期 为每年5月～9月。每个活禽市场采集1份环境综合涂抹样，采集售卖禽类流动摊贩1～2家（每家1个环境综合涂抹样），采集自养禽家庭1～2家（每家1个环境综合涂抹样）。
1.3监测采集样品 按照流感疫情防控方案的要求，进行标本的采集、保存和运输，采样使用病毒采样管，主要采集家禽粪便标本，笼具表面涂抹物，禽类饮水，清洗禽类的污水，宰杀或摆放，禽肉案板表面的涂抹物及其他标本，标本在4 ℃条件下，24 h内送到实验室，未能按时送达，至于-70 ℃以下保存。
1.4实验方法
1.4.1仪器与试剂 荧光PCR检测仪器型号为美国ABI Stepone plus Real-time PCR，核酸提取试剂来源于西安天隆科技有限公司，PCR检测试剂来源于江苏硕世生物科技有限公司，检测技术依据为《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案（2011年版）》。
1.4.2方法 采用病毒核酸提取试剂盒从环境标本中提取病毒RNA后，通过实时荧光定量聚合酶链反应，即荧光定量PCR，首先进行甲型流感病毒（FluA）通用引物核酸检测，若甲型阳性，则进行H5、H7、H9和N9亚型鉴定。
荧光定量PCR反应液体系：总体积20 μl，包括RT-PCR反应液7.5 μl、酶混合液5 μl、反应液4 μl、模板3.5 μl、去RNA酶水3.5 μl；参数设置：50 ℃，30 min，1个循环；95 ℃，5 min，1个循环；95 ℃，10 s→55 ℃，40 s，45个循环，在55 ℃荧光通道检测；探针检测模式设置：Reporter1 Dye：FAM，Reporter2 Dye：VIC，QueNcHer Dye：NoNe，Passive RefereNce：NoNe。
1.4.3结果判定 ①阴性：检测样本Ct值为UNDET或40；②阳性：检测样本Ct值≤35；③如果检测样本Ct值为35～38，需重复检测，Ct值仍在此区间且曲线呈标准S型且有明显指数增长期，则判断为阳性，否则判断为阴性。
1.5统计学处理 采用Excel 2010软件进行数据统计，SPSS 21.0软件进行统计分析，应用？字2检验和Fisher确切检验进行样本率间的比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1标本检测及分型情况 2017年5月～2018年5月共监测497份外环境标本，检出FluA病毒核酸阳性标本89份，阳性率17.91%，监测到了H5、H7、H9、N9和其他未分型的禽流感病毒。其中H9阳性标本41份，检出率最高，为8.25%；N9、H5和H7的阳性标本分别为12份、7份和6份，其检出率分别是2.41%、1.41%和1.21%；未能分型的标本为23份，占标本的总量的4.63%。
2.2不同地区禽流感外环境阳性标本分布情况 三个地区FluA阳性率最高是成华区，其次是崇州市，最低的是大邑县。成华区的检出率最高，在分型中并未检出N9型；在崇州市的检出中，H7型未检出；而大邑县未检出H5、H7和H9。不同地区的FluA阳性检出率比较，差异具有统计学意义（P<0.05），在不同地区分型实验中，H5、H7和H9比较，差异具有统计学意义（P<0.05），而N9和未分型的阳性率在不同地区比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.3不同季度禽流感外环境阳性标本分布情况 不同季度的FluA阳性检出率不同，其中第一季度的FluA阳性检出率最高，然后依次是第四季度、第三季度和第二季度，不同季度的FluA阳性检出率比较，差异具有统计学意义（？字2=21.348，P<0.05）。第一季度中，主要检出N9和H9型，未检出H7和未分型；第二季度未检出H5；在第四季度中，主要检出H9和未分型，未检出H7和N9型；第三季度与第四季度相同，未检出H7和N9型，H9的检出率最高，H5和未分型的检出率相同；其中，只在第二季度检出了H7型。不同季度的H5和H9阳性检出率比较，差异具有统计学意义（？字2=13.801和17.717，P<0.05），不同季度未分型的阳性检出率比较，差异无统计学意义（？字2=5.944，P>0.05），见表2。
3讨论
禽流感病毒主要是通过禽类的粪便以及呼吸道分泌物等方式大量排出，病毒在低温如0～4 ℃的条件下可以存活1个月以上，在室温条件下可以存活1周[6]。目前在禽流感病毒亚型中，有人感染病例报告的为H5、H6、H7、H9以及H10，其中H5和H7为高致病性的亚型[7]。
在对成都市三地区外环境禽流感病毒的监测中发现，三个地区的FluA病毒的阳性率低于成都地区整体的阳性率。在分型中，H9病毒亚型为三个地区最为流行，这与戴映雪等[8]所报道的在成都地区H5、H9为主要分型符合，但在这三个地区，H5型的污染较成都市整体低，H5和H9均具有较大潜在的危害，其中H9在禽间的流行范围最广。三个地区对比之后发现，成华区FluA病毒的阳性检出率最高，且H5、H7亚型阳性检出率较其他两个地区高，而N9亚型仅在崇州市检出，这说明在不同地区环境监测标本禽流感病毒核酸流行不同亚型，其致病潜在风险程度不同。在不同时间可以看出，第一季度和第四季度外环境的FluA病毒阳性检出率较高，其中高致病性H5亚型在第一季度阳性率最高，这与中国疾病预防控制中心在分析人禽流感病例所得结论一致，人感染禽流感的高峰期在冬春季节发生[9]。所以根据不同季节的流行情况，加大监督力度，加强监督频率，对潜在的感染因素做到有效的预防。
为有效预防人感染禽流感病毒，应从传染源、传播途径及高危易感人群方面采取积极防控措施。首先持续加强对禽流感外环境的实时监测，掌握病毒的流行趋势及特征，为制定有效防控措施提供准确的方向及科学依据；其次，在城区范围内，禁止活禽宰杀市场，并改变农村地区家禽散养的模式，有效控制传染源；加强对禽类从业人员的健康的宣传教育，提高其防护意识，注意卫生并坚持定期消毒等，降低高危易感人群感染风险。
参考文献：
[1]莫建军，周艳，董柏青.中国人感染高致病性禽流感流行特征分析[J].应用预防医学，2013，15（4）：146-148.
[2]刘伟，马利君，颜丙新，等.济宁市2013-2014年活禽市场外环境禽流感监测分析[J].应用预防医学，2015，21（6）：396-399.
[3]梅玉发，王喜云，崔龙，等.2011-2012湖北省十堰市城乡活禽市场禽流感监测分析[J].疾病监测，2013，28（11）：881-883.
[4]四川省卫生和计划生育委员会.成都确诊1例H5N1病例[EB/OL].（2016-01-13）[2016-12-10]. http：//www.scwst.gov.cn/xx/xwdt/gzdt/201601/t20160113_6568.html.
[5]中国疾病预防控制信息系统[EB/OL].（2016-01-13） [2016-12-10]. http：//10.249.1.170.
[6]杨敏，成凌志，王伟.湘潭市高危场所环境中高致病性禽流感病毒（H5N1）的监测结果分析[J].实用预防医学，2014，21（3）：366-368.
[7]何继波，段婧，郑艳，等.云南省首例人感染H5N6禽流感病例的临床与流行病学特征分析[J].现代预防医学，2015，42（21）：3852-3854.
[8]戴映雪，杜训波，杨磊，等.冬春季节成都市活禽市场禽流感病毒污染情况及其影响因素分析[J].疾病监测，2017，32（2）：135-140.
[9]胡世雄，孙倩莱，刘富强，等.2009-2011年湖南省禽流感外环境监测结果分析[J].疾病监测，2014，29（3）：207-209.
收稿日期：2018-8-21；修回日期：2018-8-30
编辑/杨倩
