中药对环境内分泌干扰物的拟雌激素活性拮抗作用*

蔡德培 芦军萍

（上海复旦大学附属儿科医院 上海 201102）

我院近二十年来，对儿童性早熟的发病规律、诊断及治疗进行了系统深入的研究，并制定了一套以中药为主的治疗方案，在临床上取得了显着疗效[1]。本文在既往采用中药成功治疗性早熟的理论及实践经验的基础上，制定了针对环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupters, EEDs)拟雌激素作用的中药治疗方案，治疗受EEDs污染的性早熟患儿及染毒动物，并以生殖器官及骨骼发育水平作为指标，验证该治疗方案对EEDs拟雌激素活性的拮抗作用。

1 材料与方法

1.1 临床实验

1.1.1 研究对象

临床上筛查出EEDs暴露水平较高的性早熟女孩73例，起病年龄6.2～8.3岁，初诊年龄6.5～11.3岁。

1.1.2 药物及治疗方法

中药方剂由生地、炙龟板、黄柏、知母等组成。由本院中药制剂室煎制成浓缩合剂，每ml约含生药2.5 g。每日3次，每次30 ml，疗程为3个月。

1.1.3 评估方法

子宫、卵巢体积测定 以Hitachi EUB 40型二维超声诊断仪测量子宫体和卵巢的长、宽、厚径，按（π/6×长×宽×厚) ml公式分别计算子宫体积和两侧卵巢的体积。

骨矿含量及骨密度测定 采用pDEXA型双能X线吸收骨矿分析仪测定左侧桡、尺骨的骨矿含量及骨密度。

血清雌二醇（estradiol，E2）及血清骨钙素（OST）检测 采用放射免疫分析法测定血清E2及OST含量，试剂盒分别由美国DPC公司及中国原子能科学研究院提供。

1.1.4 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件，治疗前后的对比采用自身配对t检验。

1.2 动物实验部分

1.2.1 实验动物及饲养条件

3周龄Sprague Dawley (SD)系大鼠，雌性40只，体重（50.00±2.00）g，购自上海斯莱克凯实验动物有限责任公司[许可证号：SCXK(沪)2003-0003]。清洁级动物房，温度为（22.00±3.00）℃；相对湿度为50.00%～60.00%，12/12小时明暗周期；动物食用标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。

1.2.2 染毒动物模型的制备

1）EEDs染毒液的配置 精确称取壬基酚(4-NP)及双酚A(BPA)（颗粒状提前研磨至粉末），以市售精制大豆油为溶剂，逐滴加入大豆油至染毒物全部溶解或呈乳浊液状后，加入足量大豆油使其终浓度分别为10 mg/ml（4-NP）和 40 mg/ml（BPA）。

2）实验动物分组及标本处理

将实验动物随机分为5组，每组8只。

4-NP实验组 100 mg/kg(1.0 ml/100 g)

4-NP治疗组 100 mg/kg(1.0 ml/100 g)＋中药合剂40 ml/kg

BPA实验组 400 mg/kg(1.0 ml/100 g)

BPA治疗组 400 mg/kg(1.0 ml/100 g)+中药合剂40 ml/kg

溶剂对照组 溶剂10 ml/kg（1 ml/100 g）

每天灌胃1次，疗程14 d。给药期间每天称重，根据体重调整药量。于末次给药24 h后称重，以3.00%水合氯醛腹腔麻醉处死。迅速剥离子宫称取湿重，计算脏器系数（子宫湿重/体重）。取两侧股骨去除肌肉及韧带组织后-20 ℃进行冻存待测。子宫称重后，中性福尔马林固定24～48 h后进行石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，常规HE染色后镜检。

3）中药合剂的药物组成及制作 方法同临床部分。

1.2.3 评估方法

1)子宫内膜及平滑肌测量方法 Panasonic MV-CP410型摄像机进行图像采集，采用IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件，放大倍数为100倍，测量HE切片子宫内膜上皮高度和平滑肌厚度。每张切片均随机选取4个视野，取平均值。

2)子宫内膜上皮的细胞增殖核抗原（PCNA）蛋白表达的检测 采用常规免疫组化方法（ABC法）检测PCNA的表达，一抗为小鼠抗大鼠PCNA单克隆IgG2a抗体。以IMS细胞图像分析软件，测定子宫内膜上皮细胞PCNA阳性细胞的面积。每张切片均随机选取4个视野，取其平均值。

3)骨密度测定 采用pDEXA型双能X线吸收骨矿分析仪测定两侧股骨的骨密度，取其平均值。

1.2.4 统计学方法

应用SPSS 11.5软件包，正态分布变量采用单因素方差分析方法，方差不齐时，用Tamhane检验，非正态分布变量用Kruskal-Wallis检验。

2 结果

2.1 临床部分

2.1.1 中药治疗对性早熟患儿生殖器官发育及血清E2水平的影响

可见筛查出的EEDs血清含量较高的性早熟患儿，经中药治疗3个月后，子宫体积较治疗前明显减小（P＜0.01）；血清 E2含量较治疗前明显下降（P＜0.01，表 1）。

2.1.2 中药治疗对性早熟患儿骨骼发育指标的影响

可见筛查出的EEDs血清含量较高的性早熟患儿经中药治疗3个月后，患儿骨矿含量、骨密度明显降低，血清骨钙素含量均显着下降（P＜0.01，表2）。

2.2 动物实验部分

表1 性早熟患儿治疗前后子宫、卵巢体积、血清E2含量的变化(±s)

表1 性早熟患儿治疗前后子宫、卵巢体积、血清E2含量的变化(±s)

注： *与治疗前相比，P＜0.01

分组 例数 子宫体积（ml）卵巢体积（ml）血清E2含量（pmol/L）治疗前 73 4.0±0.5 1.6±0.3 174.84±16.40治疗后 73 2.6±0.4* 1.4±0.3 85.91±9.65*

表2 性早熟患儿治疗前后骨骼发育指标的变化(±s)

表2 性早熟患儿治疗前后骨骼发育指标的变化(±s)

注：*与治疗前相比，P＜0.01

分组 例数 骨矿含量（g/cm）骨密度（g/cm2）血清骨钙素（μg/L）治疗前 73 0.552±0.080 0.537±0.067 16.85±3.16治疗后 73 0.399±0.093* 0.417±0.056* 10.06±3.37*

2.2.1 中药治疗对染毒动物子宫湿重、脏器系数及骨密度的影响

可见实验组与溶剂对照组相比，子宫湿重、脏器系数及骨密度均显着增高，说明4-NP及BPA对生殖器官及骨骼均有显着的拟雌激素作用；而治疗组与实验组相比子宫湿重、脏器系数及骨密度均显着下降，说明所用中药对4-NP及BPA的拟雌激素活性具有显着的拮抗作用（表3）。

表3 中药对EEDs作用下幼雌SD大鼠子宫湿重、脏器系数及骨密度的影响(±s)

表3 中药对EEDs作用下幼雌SD大鼠子宫湿重、脏器系数及骨密度的影响(±s)

注：#与溶剂对照组比较，P＜0.05，*与实验组比较，P＜0.05

分组 例数 子宫湿重(mg) 脏器系数(‰) 骨密度（g/cm2）4-NP 实验组 8 0.081±0.009# 0.74±0.13# 0.0822±0.019#4-NP 治疗组 8 0.055±0.008* 0.48±0.12* 0.0553±0.0117*BPA实验组 8 0.067±0.007# 0.61±0.13# 0.0940±0.0172#BPA治疗组 8 0.051±0.005* 0.40±0.05* 0.0596±0.008*溶剂对照组 8 0.042±0.007 0.36±0.02 0.0651±0.0101

2.2.2 中药治疗对染毒动物子宫内膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表达的影响

可见实验组与溶剂对照组相比，子宫内膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA的蛋白表达水平均显着增高，说明4-NP及BPA对生殖器官具有显着的拟雌激素作用；而治疗组与实验组相比，子宫内膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA的蛋白表达水平均显着下降，说明所用中药对4-NP及BPA的拟雌激素活性具有显着的拮抗作用（表4）。

3 讨论

EEDs可通过与靶器官上的雌激素受体（ER）结合发挥拟雌激素作用。ER具有多个配体结合部位，除能与天然雌激素结合外，还可与多种EEDs结合。EEDs与ER结合后可激活ER启动基因转录促进蛋白合成，也可以与天然雌激素发挥协同作用，激发雌激素效应的产生[2]。

本研究临床部分的结果显示，对筛查出的EEDs血清含量较高的性早熟患儿，给予中药合剂口服治疗3个月后，患儿的子宫体积明显回缩，血清E2含量显着下降，骨矿含量、骨密度及血清OST含量也显着下降，说明中药合剂对EEDs在患儿生殖器官及骨骼上的拟雌激素效应具有显着的拮抗作用。

表4 中药对EEDs作用的幼雌SD大鼠子宫内膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表达的变化(±s)

表4 中药对EEDs作用的幼雌SD大鼠子宫内膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表达的变化(±s)

注：#与溶剂对照组比较，P＜0.05；*与实验组比较，P＜0.05

分组 n 内膜上皮高度(μm) 平滑肌厚度(μm) 阳性细胞面积(μm2)4-NP实验组 8 23.27±5.64# 82.29±13.92# 5 490.25±678.58#4-NP治疗组 8 17.45±4.30* 55.20±10.20* 4 301.59±464.02*BPA 实验组 8 20.85±2.94# 68.27±7.42# 5 062.76±182.34#BPA治疗组 8 16.63±3.42* 48.77±5.03* 4 114.62±223.80*溶剂对照组 8 9.75±2.59 33.66±5.60 3 350.55±394.15

本研究动物实验部分的结果显示EEDs可使染毒动物子宫增重、子宫内膜及平滑肌增生、子宫内膜PCNA的蛋白表达上调、骨密度增高，说明EEDs对生殖器官及骨骼均具有显着的拟雌激素作用；同时喂饲中药合剂可使染毒动物生殖器官及骨骼的病变显着减轻，进一步印证了临床观察的结果，证实所用的中药合剂对EEDs的拟雌激素活性具有显着的拮抗作用。

[1] 蔡德培. 性早熟及青春期延迟[M]. 上海: 上海科学献出版社, 2005: 163-171.

[2] Simons SS Jr. Environmental estrogens: Can two “Alrights ”make a wrong?[J]. Science, 1996, 272(5267): 1451.