卫玲赵莹 徐晓晶*
（上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心 上海 201203）
碳酸酐酶Ⅱ基因克隆及在毕赤酵母中的异源表达*
卫玲**赵莹 徐晓晶***
（上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心 上海 201203）
碳酸酐酶Ⅱ（carbonic anhydrase Ⅱ, CA Ⅱ）是参与机体多种代谢活动和病理活动的一种重要催化酶。通过基因重组、电转化等方式，得到能异源高表达人CA Ⅱ的毕赤酵母（Pichia. pastoris）GS115工程菌。对工程菌进行培养及甲醇诱导后，经离子交换层析柱分离纯化后得到较纯的重组CA Ⅱ。通过Western blotting、酶活力及圆二色谱检测发现重组和商品化CA Ⅱ具有相似的酶活力和构象，为CA Ⅱ今后进一步在临床的研究和工业应用打下了基础。
碳酸酐酶Ⅱ 毕赤氏酵母 异源表达 甲醇诱导
碳酸酐酶（carbonic anhydrases, CAs，EC 4.2.1.1）是一类含锌金属酶[1]，由Meldrum和Roughton于1933年首次从红细胞中分离纯化得到[2]，现已证实其广泛存在于生物体内，包括动物、植物、水藻、细菌以及古细菌。根据其氨基酸序列的不同，碳酸酐酶至少有α、β、γ、δ、ε、ζ等六种不同类型[3-4]。多年来人们对碳酸酐酶的研究主要集中在与人类关系密切的α-CAs和β-CAs上[2]。人体中的α-CAs至少存在14种同工酶（HCA I-XIV），因CA Ⅱ在红血球中的大量分布，使其成为研究最广泛的同工酶[5-6]。CA Ⅱ分子量约为30 kDa，它的活性中心主要由两部分组成：一是在配基His-94，His-96，His-119，Thr-199，Glu-106，His-64参与下Zn2+与H2O或OH-形成的多面体；二是在上述多面体的临近处有一个由Leu-198，Val-143，Val-121，Trp-209组成的结合有CO2的疏水袋。
由于该酶在体内分布广泛，虽然其催化的只是一个简单的生理反应，但是其催化的底物CO2及产物HCO3-、H+却与人体多种生理及病理活动关系密切，如呼吸过程中代谢组织与肺之间CO2/HCO3-的转运，pH与CO2浓度之间的平衡，组织器官中电解质的分泌，青光眼、骨质疏松症、癫痫、肿瘤等疾病的形成等。若该酶表达异常或活性发生改变都会引起机体的病变，纠正该酶异常表达或抑制该酶的过高活性也能对CA Ⅱ引发的疾病起到积极的治疗作用[7]。例如，CA Ⅱ抑制剂能有效降低眼内压，减少HCO3-的生成，进而减少房水的生成，可用于治疗青光眼[8-9]。另外，该酶也与骨质疏松的发生有关，由于CA Ⅱ的表达随着破骨细胞功能状态的不同而发生变化，在骨吸收状态下它呈高表达，所以抑制该酶活性可以降低破骨细胞的骨吸收作用，改善骨吸收的酸性微环境，从而达到防治骨质疏松症的目的。这使得CA Ⅱ成为多种人类疾病研究中的重要靶点，对该酶的研究也逐渐成为热点[10-12]。
1 材料
分泌型表达质粒pPIC9K，Pichia pastoris GS115均由复旦大学宋大新老师惠赠。限制内切酶、Taq DNA聚合酶购自Promega公司；蛋白胨、酵母提取物等培养基均购自上海生工公司，抗CA单克隆抗体（一抗）购自Medix，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（二抗）购自晶美公司，引物均由上海生工公司合成； 商品化CAⅡ对照购自USCN公司。
2 方法
2.1 caⅡ基因的克隆、表达质粒构建及电转化至毕赤酵母GS115
以人胎盘组织提取的总RNA进行反转录，按反转录试剂盒说明书的方法合成cDNA；设计引物5’-Primer：(GACCCAAT)CTCGAGGCAGTGGTCAAAGTGCCCCTG（下划线为Xho I 位点），3’-Primer：(GT)GCGGCCGCTTA GGCGGCAGTGGCAAAGC（下划线为Not I位点），再以cDNA为模板通过PCR扩增获编码CA Ⅱ的基因片段（PCR条件： 95 ℃，5 min； 94 ℃变性30 s； 54 ℃退火30 s； 72 ℃延伸40 s；循环32 次； 最终70 ℃ 10 min，于16℃保存），扩增的caⅡ基因片段经Xho I和Not I双酶切克隆至P. pastoris的分泌型表达载体pPIC9k，获得表达质粒pPIC9k-CAⅡ（图1）。
所构建的表达质粒pPIC9k-CAⅡ用Bgl II酶切线性化，电转化P. pastoris GS115（His mut+）的感受态细胞，取200 ml涂布MD平板，于30℃培养至单菌落出现，得到1 000余个转化子[13]。
2.2 筛选高表达CA Ⅱ的毕赤酵母重组菌株
将上述1 000余个转化子依次点种到含G418分别为1、2、3和4 mg/L的YPD平板上，30 ℃培养，在含4 mg/L的G418平板上获得35个G418抗性转化子。
从上述35个G418抗性转化子中随机选择22个单菌落分别接入含3 ml BMGY培养基中，30 ℃，220 r/min振荡培养24 h；每份菌液各吸取1.5 ml接入含40 ml BMGY的培养基，同样条件下培养24 h，于室温离心 1 500 g，6 min，收集菌体。将菌体重悬于15 ml BMMY培养基中，同样条件下培养24 h，加入培养基体积1%的甲醇进行诱导表达。分别在诱导12、24和36 h时取样做SDS-PAGE电泳，筛选获得7株具有约30 kDa蛋白条带的高表达工程菌株[14]。
图1 重组pPIC9k-CAⅡ质粒的构建
2.3 重组CA Ⅱ在毕赤酵母中的异源高表达
从YPD斜面培养基挑选单菌落，接入含40 ml BMGY的250 ml 摇瓶，30 ℃，220 r/min振荡培养24 h。收集菌体用200 ml BMMY诱导培养基悬浮，同样条件下培养36 h，培养24 h时补一次甲醇，体积为培养基体积的1%。
2.4 重组CA Ⅱ的Western-blot鉴定
将电泳后的SDS-PAGE凝胶剥离，按照文献的方法进行电转移[15]、脱脂牛奶封闭、一抗及二抗孵育，然后显色、漂洗并终止显色，观察Western-blot实验结果。
2.5 重组CA Ⅱ的分离纯化
发酵上清液边搅拌边缓慢加入硫酸铵至饱和度为60%，冰浴搅拌2 h后1 500 g离心，弃上清，沉淀用50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5缓冲液复溶。复溶液用截留分子量为10 kD的透析袋对50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5透析过夜，然后，进行离子交换层析（Q-Sepharose Fast Flow，CV=1 ml，流速：1mL/min）。离子交换洗脱液A1 为50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，B1为1 mol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，分3段梯度洗脱，梯度分别为：35%B1、60%B1、100%B1，每段洗脱体积为10×CV、时间10 min。
2.6 重组CA Ⅱ酶活力测定
碳酸酐酶活力的测定参照Brownell等[16]方法略作改进：在一个4 ℃的冷冻反应室中, 加入5 ml巴比妥-KOH缓冲液（20 mmol/L, pH 8.3），并加入0.5 ml煮沸或未煮沸的CA Ⅱ，再注入4.5 ml 冰冷的CO2饱和水，测定pH下降的速度差异。酶活单位数(U)由公式10(T0/Te-1)求得，T0和Te 分别为加入煮沸和未煮沸CA Ⅱ测得的pH下降1所需时间。酶活力以每mg 蛋白含有的酶活单位数（U/ mg）表示[17]。以购买的商品化CA Ⅱ为标准参照（酶活力约为209 U/ml）。
2.7 酶稳定性研究
2.7.1 不同pH对酶稳定性影响
重组与商品化CA Ⅱ（浓度均为0.02 nmol/L）在pH 为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0时分别放置10 min，测定酶活力。
2.7.2 不同温度对酶的稳定性影响
重组与商品化CA Ⅱ（浓度均为0.02 nmol/L）在25～65 ℃范围，每隔5 ℃放置10 min，测定酶活力。
2.8 圆二色性比较
重组与商品化CA Ⅱ浓度都为1.0 mg/ml，上海药物所J-810圆二色光谱仪（日本分光 JASCO）在190～320 nm波长范围内检测，研究两者构象的相似程度。
3 结果
3.1 RT-PCR扩增重组caⅡ基因
按照2.1方法扩增了重组caⅡ基因，得到大小为800 bp的片段。电泳检测见图2。
3.2 caⅡ的基因克隆和重组表达质粒的构建
图2 扩增caⅡ基因的电泳图
将克隆得到的caⅡ基因测序，并与GenBank中的人ca Ⅱ基因cDNA序列进行比较。结果表明我们获得的caⅡ（NM000067）基因序列与数据库中的人ca Ⅱ基因序列100%匹配。得到的表达质粒pPIC9K-CAⅡ，导入P. pastoris GS115后进行筛选，经PCR扩增鉴定阳性转化子插入片段大小正确（图3）。
图3 编码人caⅡ基因的PCR扩增电泳图
3.3 表达条件试验
从图4可以看出，随着发酵诱导时间的延长，目的蛋白的表达量无明显升高。通过SDS-PAGE电泳图谱判断，加甲醇诱导表达24 h时蛋白条带最深，表明其蛋白表达量最高。故确定CAⅡ在BMMY培养基中的最佳诱导表达时间为24 h。
图4 不同诱导时间表达的CA Ⅱ的SDS-PAGE电泳
3.4 Western blotting鉴定
SDS-PAGE电泳图谱表明：重组CA Ⅱ的分子质量与对照商品化CA Ⅱ一样，约30 kDa。Western blotting结果表明在与SDS-PAGE电泳的特异蛋白条带相应位置出现一条特异的杂交带（图5）。
图5 SDS-PAGE（左）及Western blotting（右）图谱
3.5 重组CA Ⅱ的分离纯化
经QFF离子交换柱纯化，收集的第8管到第15管样品含有较纯的重组CA Ⅱ。测定合并后的CA Ⅱ的比活力为188 U/mg。
图6 重组CA Ⅱ纯化图谱
图7 纯化CA Ⅱ的SDS-PAGE电泳图
3.6 重组CA Ⅱ的稳定性
3.6.1 不同pH对酶活力的影响
pH对两种CA Ⅱ酶活力影响的试验表明，pH对两者的酶活力影响基本一致，pH为7.0时活性最高（记为100%），pH为1.0时酶活力最低（图8）。
图8 不同pH对酶活力的影响
3.6.2 不同温度对酶活力影响
在温度为35～45 ℃时酶活力最高（记为100%），然后呈现急剧下降的趋势，当温度为65 ℃时，酶活力达到我们试验的最低点（图9）。
图9 不同温度对酶活力的影响
3.7 圆二色性比较结果
圆二色性比较结果显示重组和商品化CA Ⅱ的构象基本一致(图10)。
图10 圆二色性比较
4 讨论
本研究构建了重组CA Ⅱ的Pichia. Pastoris异源表达系统，高效表达人重组CA Ⅱ，分离纯化后得到较纯的重组蛋白。经酶活力检测及圆二色谱分析等发现该重组蛋白与商品化CA Ⅱ具有相似的酶活力及构象。该酶在35～45 ℃时活性最高，随着温度的上升，其活性急剧下降。由于该酶在碱性条件下出现了沉淀，故未做碱性条件下的酶活力试验。
本研究克隆的重组CA Ⅱ有助于其在毕赤酵母中的发酵生产及大量制备，将来可作为抗原蛋白开发青光眼、骨质疏松等疾病的诊断试剂，也可以作为药物靶点蛋白研发针对这些疾病治疗的抑制剂，为其进一步在医药开发方面的应用奠定了基础[18]。
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Cloning of a gene encoding carbonic anhydrase Ⅱand heterologous expression in Pichia pastoris*
WEI Ling**, ZHAO Ying, XU Xiaojing***
(Shanghai Biochip Co. Ltd./ National Engineering Center for Biochip at Shanghai, Shanghai 201203, China)
Carbonic anhydraseⅡ(CAⅡ) is an important enzyme involving in various metabolic activities and pathological activity. A gene coding for carbonic anhydraseⅡwas cloned from human placenta and an expression plasmid was constructed with plasmid pPIC9K and introduced into a strain of Pichia. pastoris GS115 by electro-transformation to obtain an engineered strain. The recombinant CAⅡwas heterologously overexpressed in the engineered strain GS115 by induction with methanol and purified by anion-exchange chromatography. The purified recombinant CAⅡwas verified to have very similar characteristics to a commercial CAⅡthrough Western blotting，enzyme activity analysis and circular dichroism spectra. This work can lay a foundation for the clinical research and industrial application of CAⅡ in the future.
carbonic anhydraseⅡ; Pichia. pastoris; heterologous expression; methanol induction
Q78
A
1006-1533(2015)17-0074-05
国家863项目（2006AA02A252）；上海市科委创投联动计划 （13CT1900900）
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卫玲（1977-），女，硕士，工程师，从事蛋白质表达及分离纯化研究。E-mail: sophyling@ mail.sh.cn
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徐晓晶，博士，副研究员。E-mail: xiaojing_xu@shbiochip.com
2015-05-29）
