在肿胀技术注射器吸脂和传统单纯自体颗粒脂肪注射填充移植[1]及脂肪组织源性干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）等[2]实验与临床研究基础上，2006年，Matsumoto等[3]提出ADSCs协同自体脂肪移植（cell-assist ed lipotransfer，CAL）概念，Yoshimura等[4]同期应用CAL成功进行了临床隆乳术；2008年，刘乃军等[5]在上述CAL基础上，提出干性CAL和湿性CAL概念，并应用湿性CAL技术成功进行了临床多量自体颗粒脂肪移植，临床获得明显提高[6]。现就ADSCs技术在临床颗粒脂肪注射移植方面的研究进展综述如下。
1传统单纯干性和湿性颗粒脂肪注射移植方法
过去27年里，在湿性肿胀技术和注射器吸脂等基础上[7]，传统单纯自体颗粒脂肪注射移植方法分为（离心法）干性移植法[8-9]（应用离心技术分离浓缩纯化颗粒脂肪）和（静置法）湿性移植法[10-11]（不用离心技术而是采用自然静置悬浮反复漂洗析出水分等杂质纯化颗粒脂肪）；迄今两者仍是临床最常用的操作流程，公认为安全、有效的治疗方法，但有关颗粒脂肪注射移植术后存活率各家报道不一，且争议较大，要真正建立公认的临床规范标准化操作流程，仍需做出更多改进[12-13]，目前，我国自体颗粒脂肪注射填充移植技术已经进入世界先进行列。
2自体ADSCs和SVF来源
近年研究证实，在人体吸脂颗粒脂肪悬液中获取的多向分化ADSCs是安全理想的自体细胞来源[14]，2007年，朱茗和高建华等[15]实验研究从成人脂肪抽吸物液体部分中分离得到大量可为脂肪组织工程所利用的ADSCs，其细胞量与脂质来源的量基本相同。2009年，Yoshimura等[16-17]实验研究吸脂抽吸物获得大量自体血管基质层片段细胞（stromal vascular fraction，SVF）。2010年，付冰川和高建华[18]等实验研究认为新鲜SVF与培养的ADSCs一样，可提高脂肪移植物存活率，前者操作更方便、省时、安全、高效，后者难以满足临床实际需要；其实，通过吸脂术获得颗粒脂肪内血管间质碎片（SVF）“微粒”含有多种类型多功能干细胞，其中就包括ADSCs，新鲜SVF直接添加到颗粒脂肪移植混合填充物中，不需额外处理，对颗粒脂肪移植混合填充物较少人工处理，更能改善脂肪细胞、ADSCs、SVF活性，额外人工处理纯化方法与脂肪细胞、ADSCs、SVF的细胞数量和活性无关，新鲜ADSCs和SVF可自然混合在颗粒脂肪移植填充物中，直接注射填充移植为脂肪组织工程所利用[19]；目前，虽很难证实新鲜ADSCs和SVF细胞准确数量及对体内移植颗粒脂肪在构建脂肪组织过程中确切辅助作用机制，关键是可避免体外离心浓缩及分离培养ADSCs和SVF过程中可能出现细胞基因变异问题[20]。关于ADSCs的应用，目前仍有许多重要问题有待探索解决，首先ADSCs在无免疫力的移植受体上表现出的肿瘤样无限增生特性，在进入临床实验前仍需寻找并建立合适动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性；其次，在批量提取生产ADSCs过程中，如何保障细胞质量均一稳定仍然有待深入研究。
3离心法与静置法对ADSCs和SVF的影响
对于吸脂抽吸物是否需要离心，迄今仍有很大争议，一些学者一直倡导采用自然静置悬浮漂洗或不漂洗法，另外一些学者则主张离心分离浓缩纯化法；目前临床还无公认合理的离心速度，Kurita 等[22]认为过快离心速度反而会破坏ADSCs完整性[21]；杨东运等认为低速离心并不能显着提高面部自体颗粒脂肪移植存活率；雷华等[23]认为大于等于600rpm均会损伤颗粒脂肪活性，建议颗粒脂肪移植慎用离心法，宜采用静置法，以最大程度保护颗粒脂肪免受损伤。2011年，Botti等[24]经长期临床验证认为注射移植的颗粒脂肪细胞其吸收、存活情况与脂肪离心分离浓缩纯化技术无关。研究表明，颗粒脂肪离心分离浓缩纯化方法与细胞数量和活性无关，注射器法吸脂吸出的颗粒脂肪不必进行离心和漂洗，宜采取自然静置悬浮法析出无用水分和杂质，最大程度保护颗粒脂肪混合填充物免受损伤[25]。
4ADSCs和SVF体外提取分离培养过程及存在问题
ADSCs和SVF体外分离、提取、培养、制作、注射为一体的处理过程均需在高标准无菌手术室和净化室采用专用设备完成[26]。操作复杂繁琐成本高，ADSCs诱导液常含有与肿瘤发生转移有关的生长因子，且价格昂贵不易推广普及[27]。将离心浓缩纯化后颗粒脂肪与体外分离、培养的ADSCs和SVF细胞混合填充物复合同步移植，该项技术尚不成熟，目前仍处于进一步研究阶段。关于ADSCs和SVF的临床应用，目前仍有许多重要问题有待探索解决，《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（简称新版药品GMP） 认为干细胞治疗需要严格按照药物研发的一般流程，包括研发筛选、临床前研究、临床阶段、新药批准上市几个主要阶段[28]，当前FDA和SFDA还未批准分离培养的ADSCs和SVF用于任何临床领域。目前为止，干性CAL技术主要是在体外细胞培养皿及试管中或动物身上进行实验研究，须经由严谨人体试验证实，不但要有稳定成活率和肯定疗效，而且还要有标准统一的质量控制和临床治疗规范化管理，只能允许有限的人体可忍受，不影响健康的副作用和无严重并发症发生，不改变受植区组织结构、不干扰受植区成像、不影响受植区恶性肿瘤筛查、不干扰受植区恶性肿瘤诊断，在这些条件完全具备后方可临床推广应用。干性CAL目前在临床治疗上并没有太大实际价值，进入临床应用前仍需慎之又慎，切勿盲目过早开展临床应用。进入临床试验前仍需寻找并建立合适动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性，特别是目前还无法保证经离心后体外分离培养的ADSCs和SVF是否出现细胞基因变异瘤化问题；有研究显示，长时间培养的ADSCs可使免疫缺陷小鼠发生肿瘤[29-30]。目前尚无一安全稳定并行之有效的培养、诱导方式，以及在批量提取生产ADSCs和SVF过程中，如何保障细胞质量均一稳定性，有待进一步研究。
5干性CAL和湿性CAL主要区别及临床效果
主要区别在于干性CAL是应用离心技术分离浓缩纯化自体颗粒脂肪及体外分离、培养ADSCs和SVF，手术需二次完成，难以满足临床需要，还没有经过严格循证医学的临床对照研究检验，另外还有一些伦理道德方面问题需探讨。刘晓燕等[31]临床应用ADSCs（干性CAL）治疗面部老化症和面部凹陷症，局部症状明显改善，但长期效果尚待进一步观察。湿性CAL是不用离心技术去除吸脂抽吸物液体和脂质中大量ADSCs和SVF，不体外分离培养ADSCs和SVF（注射器内自然静置悬浮不漂洗法），新鲜ADSCs和SVF自然混合在颗粒脂肪填充物中直接注射移植，手术可一期完成，操作简易、快速、安全、经济、并发症少；湿性CAL是未离心分离培养的新鲜ADSCs和SVF“微粒”与颗粒脂肪混合填充物复合同步移植，临床技术基本成熟，规避了许多体外培养细胞移植伦理道德方面问题，经过了严格循证医学的临床对照研究和检验，有26年传统单纯自体颗粒脂肪（干性/湿性）注射移植经验可借鉴[32]。
2011年，鲁峰[33]采用新鲜获得SVF，不体外分离、培养ADSCs和SVF，一次完成临床手术，治疗11例，认为新鲜干细胞辅助能提高游离移植脂肪组织存活率，是一种安全有效的治疗软组织缺损方法。除此之外，干性CAL和湿性CAL在抽取颗粒脂肪和注射移植过程中均符合“三低三多” 颗粒脂肪注射移植原则和“3L3M”技术规则[34]。如果干性CAL效果并不优于湿性CAL，那我们一定更愿意选择操作简便、效果安全可靠的湿性CAL方法，湿性CAL初步解决了制约单次多量颗粒脂肪注射移植术后存活率的重要难题，公认的标准化湿性CAL操作流程应该是：①吸脂术：采用手工注射器注射肿胀液（尽量避免压力过高过快）和注射器吸脂法；②制备新鲜湿性颗粒脂肪及干细胞“微粒”混合填充物：20ml螺口专用一次性注射器和1.5～2mm无创吸脂针吸脂，每次吸满一支注射器毕，将注射器直立自然静置悬浮后只排出注射器内颗粒脂肪下层少许水分（若水分很少，亦可不排出），不拨除注射器芯，将吸脂抽吸物由注射器桶后口倾倒入生理盐水盆中悬浮漂洗颗粒脂肪抽吸物，不排出静置后注射器内颗粒脂肪上层脂质（油脂）部分，不离心浓缩纯化分离颗粒脂肪和干细胞“微粒”，不排出注射器内自然静置后混合填充物微粒间液体部分（因其内富含未经分离新鲜ADSCs和SVF），直接注射填充移植用；③湿性CAL隆乳和隆臀及隆乳假体取出后即刻注射隆乳术：注射移植前受区先局部肿胀浸润麻醉（0.125%盐酸利多卡因含1：1000000肾上腺素溶液） 使各层次组织液压膨胀和疏松无创分离，并根据注射肿胀液体积量计算出湿性填充物微粒注射需要量，实际注射量要比受区注射需要量再增加30%～50%体积，注射填充过枉矫正；单点微量（0.5～1ml）、多点、多隧道（在形成隧道退针同时注射，将颗粒脂肪和干细胞“微粒”定位于受植床内）、多平面注射，隆乳注射量为120～180ml/侧，隆臀220～360ml/侧，局部肌肉内可分多层注射以保证良好血运和尽量减少损伤；④体表局部凹陷及面部多量自体颗粒脂肪注射填充移植：可根据受区具体情况个性化处理后，多量自体颗粒脂肪注射方法同上，局部凹陷重点是采用肌肉内分多层注射以保证良好血运和尽量减少损伤，湿性CAL美容性丰面，重点是采用全面部深层肌肉内多层次注射移植，注射量为100～160ml/例。因矫枉注射填充，受区术后早期有明显肿胀，术后48h内可间断冰敷， 72h后可局部热敷理疗，1周内均恢复自然；湿性CAL均采用单次注射填充移植完成， 无需重复注射移植即可达到较为满意的治疗效果；截止目前，这是含有自体新鲜ADSCs和SVF辅助多量颗粒脂肪注射填充移植操作最简单、颗粒脂肪和干细胞“微粒”损伤最轻、受区血运条件最佳、安全合理的临床标准规范操作流程之一，从注射肿胀液到颗粒脂肪抽吸毕，颗粒脂肪注射填充物加工完成，注射到受区至术毕，这段规范公认的标准化操作流程时间，在操作医生安全可控范围内，操作时间越短，颗粒脂肪填充物所含脂肪细胞、ADSCs、SVF等活性越高；反之操作时间越长，细胞活性会随时间延长而越来越低[35]。
6现代影像学技术在CAL中的作用
随着现代影像学技术（MRI[36]、螺旋CT、多层螺旋CT血管造影、MDCTA三维重建技术[37]、最新三维扫描技术测量隆乳术后乳房体积变化术[38]）的发展，现今可有效、客观、精确、测量、评定、验证CAL术后效果及干性CAL和湿性CAL术后区别，湿性CAL术后18个月MRI成像观察隆乳后部分个例仍显示有脂肪组织有效增殖，乳房MRI检查很容易分辨出坏死脂肪，发生率不足1%，术后不改变乳腺组织结构，不干扰乳腺成像，不影响乳腺恶性肿瘤筛查，不干扰乳腺癌诊断[39]；MRI对湿性CAL隆臀术不同注射层面颗粒脂肪移植后的寿命可进行定量分析，同时对脂肪坏死钙化的鉴别诊断能力明显提高[40]。临床上Rubin等[41]使用精确成像工具验证干性CAL注射移植隆乳术具有较低并发症发生率，术后6个月仍有有效组织存活，且未出现肿块及其他结构改变。
7CAL技术与受区血运的关系
ADSCs体外培养过程中，有学者发现该细胞群具有稳定的倍增效应和低衰老性，可向多种细胞类型分化，能分泌血管内皮生长因子等多种细胞因子[42]。李劼等[43]自人体吸脂术中脂质部分分离培养ADSCs，在体内ADSCs能够分化为血管内皮细胞并促进游离移植脂肪组织再血管化，提高脂肪组织存活率并减轻纤维化，ADSCs辅助颗粒脂肪移植（干性CAL）可能是一种较为理想的细胞疗法。目前学者们对干性CAL和湿性CAL持有不同观点，但为获得预期移植效果，保证良好血运和尽量减少损伤，却已形成共识，因血运不良及损伤程度均对移植效果有直接影响。自体颗粒脂肪注射移植后，血运重建是脂肪组织再生基础，脂肪细胞存活率及存活时间影响因素很多，其中最大限度减低颗粒脂肪损伤，受区尽早及时建立有效血运循环是关键[44]。注射至肌内不同层次，每层注射较少颗粒脂肪，可保证每个颗粒脂肪都有血供包围营养，更易存活，现已逐渐成为主流颗粒脂肪注射移植方法[45]。近年许多实验研究在移植颗粒脂肪中加入各种生长因子，以促进移植颗粒脂肪组织内血管增生和脂肪细胞分化[46]。ADSCs和SVF均能自身分泌血管内皮生长因子等多种内源性细胞生长因子，直接参与增强注射移植颗粒脂肪血管化过程并减低纤维化[47]。2011年，黎洪棉等[48]实验研究结论：ADSCs与外源性血管内皮生长因子共同参与新生脂肪组织的血管化过程，血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素；血运重建是移植脂肪组织再生基础，颗粒脂肪注射移植后，尽量减少损伤和保证良好血运是多量颗粒脂肪注射移植成活的核心因素。扁平、容积小、皮肤紧的乳房，很难容纳多量颗粒脂肪，预扩张技术采用体外扩张器（BRAVA乳房增大系统辅助自体脂肪移植隆乳）可暂时增大乳房容积，弥补乳房空间的不足，在注射移植颗粒脂肪隆乳前即极大改善了受区血，使隆乳颗粒脂肪能获得足够血运，远期美容效果明显提高[50]。湿性CAL颗粒脂肪注射移植前，受区先局部肿胀浸润，使各层次组织液压膨胀和疏松无创分离，即在受区局部肿胀浸润呈现一个“生理湿性内环境”，使注射移植混合填充物微粒易自行弥散开，不易形成脂肪结节，又对体表软组织凹陷及扁平小乳房等受区部位起到一定的术中即时预扩张作用[51]。
8小结和展望
由于不同条件、不同操作者及不同受术者的不确定性因素差异，CAL效果都会有不尽相同。湿性CAL的有效性和安全性仍需大样本临床人体应用进一步远期观察，以确定其长期安全、高效[52-53]。ADSCs和SVF临床应用前瞻性研究，定会创造整形外科新未来，也会有助于整形美容外科临床治疗方法改进提高[54]。湿性CAL应是现阶段多量自体颗粒脂肪注射移植临床医学美容和整形治疗方面的首选技术[55]，目前自体ADSCs分离、提取、培养技术在国际上还没有正式开展临床应用，设备价格昂贵是其没有开展的主要障碍之一。我们仍需不断研究，以确定CAL对颗粒脂肪注射填充移植成活率的影响机理，现今我国在世界CAL研究领域里处于领先水平，相信CAL技术在整形美容外科范畴具有更广阔的应用前景。
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[收稿日期]2012-04-28 [修回日期]2012-06-11
编辑/李阳利
