刘彩云，王卓娅，罗欣茹，章戴荣，梁高卫，吴培诚
（1.广东药科大学基础学院 广东 广州 510006；2.广州莱德尔生物科技有限公司 广东 广州 510000；3.广州天吻娇颜化妆品有限公司 广东广州 510990）
防脱复合中药单体自微乳及微乳凝胶剂的研究
刘彩云1，王卓娅1，罗欣茹2，章戴荣2，梁高卫3，吴培诚1
（1.广东药科大学基础学院 广东 广州 510006；2.广州莱德尔生物科技有限公司 广东 广州 510000；3.广州天吻娇颜化妆品有限公司 广东广州 510990）
目的：本实验研究防脱复合中药单体自微乳及其微乳凝胶剂，并对其理化性能、稳定性能进行评价。方法：筛选合适的油相，表面活性剂，助表面活性剂，并采用水滴定法绘制伪三元相图，筛选最佳Km值，考察防脱复合中药单体自微乳及其微乳凝胶剂的平均粒径和稳定性。结果：当Km=2时，得出纳米乳区域最大，初步获得最佳处方PEG-40氢化蓖麻油：丙三醇：辛基十二烷醇∶复合中药单体为52∶26∶12∶10，防脱复合中药单体自微乳的平均粒径22.64nm，在低温和常温下很稳定，其微乳凝胶剂的平均粒径是42.87nm，耐寒、耐热、常温实验结果都较理想。结论：防脱复合中药单体自微乳及其微乳凝胶剂制备工艺简便，粒径小，稳定性好，是有应用前景的经皮给药制剂。
自微乳；微乳凝胶剂；复合中药单体；经皮给药制剂；最佳Km
脂溢性脱发（Seborrheic,alopecia,SA），又名雄激素原性脱发（Androgenie alopecia,AGA），常表现为头发油腻、多屑、有明显瘙痒感、额颞区及顶部的渐进性脱发，继而形成高额。脂溢性脱发是皮肤科临床的常见病、多发病，也是难治疾病之一，由于本病有碍容颜, 影响美观，常给患者带来很大的精神压力和心理负担, 因此脂溢性脱发的研究受到许多相关研究者广泛的重视[1]。现代医学研究显示遗传因素是脂溢性脱发发生的主要原因之一；而雄激素过多或对雄激素敏感增加是该病发生的主要因素, 5α-还原酶异常与该病发生有重要关联。除上述因素外，长期精神紧张、饮食失调、心理失衡及病菌感染( 如糠秕马拉色菌、痤疮丙酸杆菌等) 为诱发或加重本病的重要因素[2]。针对脂溢性脱发的治疗方案包括西医与中医疗法，西药以单一靶点为主，如内服药物非那雄胺和外用米诺地尔酊剂主要通过拮抗雄激素，存在使用者雌性化、皮肤刺激性大的副作用[3]；中医治疗主要使用了传统中医理论进行中草药治疗，以多靶点为主，目前已有的发明主要基于中医治疗脱发的辨病与辩证相结合原则，通过筛选养血安神、疏肝解郁、益气生发的天然植物药来组方，但这些中草药复方或相关制剂针对脂溢性脱发各个靶点的有效物及含量并不确定，且市面上大多中草药制剂为酊剂，对头皮刺激性大[4-5]。
针对以上缺点，本课题组通过已有的文献及验方资料，筛选出了抑制5α-还原酶和雄激素受体及抑菌三个靶点的中药单体，它们分别是槲皮素，黄芩苷，和厚朴酚，由于这些单体的水溶性差，将它们复配制成自微乳。自微乳是由油相，表面活性剂，助表面活性剂及药物形成的均一、稳定的透明或半透的液体，加水可以无限稀释，其粒径在100nm以下，是一种有效的经皮给药制剂中间体[6-7]。目前，自微乳在口服给药制剂中研究得较多，在外用皮肤给药制剂中鲜有报道，本课题组尝试制备含三种中药单体的自微乳制剂及自微乳和凝胶技术相结合制备防脱复合中药单体微乳凝胶，预期改善传统防脱制剂刺激性大，靶点相对单一，及传统中药复方制剂有效物及含量不确定等缺点。
1 实验设计与方法
1.1 试剂与仪器：槲皮素，黄芩苷，和厚朴酚，碳酸二乙基己酯、辛基十二烷醇、碳酸二辛酯，PEG-40氢化蓖麻油，聚甘油-10油酸脂，1-2丙二醇，丙三醇，无水乙醇，卡波姆941，羟丙甲酯，苯氧乙醇，三乙醇胺，去离子水均由广东莱德尔皮肤工程和药物研发中心提供。 BS110 S 型电子天平 ( 德国 Sartorius 公司 )，Zetasizer-nano-zs90（马尔文仪器有限公司），DV-S数显粘度计（美国Brookfield公司）。
1.2 防脱复合中药单体自微乳的制备
1.2.1 辅料的选择：在查阅大量文献及预实验的基础上，分别称取槲皮素、黄芩苷、和厚朴酚各0.010g，依次溶于2.500g的碳酸二乙基己酯、辛基十二烷醇、碳酸二辛酯，0.500g的PEG-40氢化蓖麻油、聚甘油-10油酸酯, 2.500g的1-2丙二醇、丙三醇、无水乙醇，超声5min, 各溶解情况见表1。
由于药物与油相、表面活性剂，助表面活性剂的相溶越好，所形成的微乳越稳定，所以油相选择辛基十二烷醇，表面活性剂选择PEG-40氢化蓖麻油，对于助表面活性剂1-2丙二醇，丙三醇，槲皮素、黄芩苷、和厚朴酚能微溶于其中，而无水乙醇能完全溶解这三种中药单体，考虑到无水乙醇对皮肤的刺激性，不选择其作为助表面活性剂,而在自微乳中，助表面活性剂直链比支链更有利于微乳的形成，因此选择丙三醇为助表面活性剂[8]。
表1 槲皮素、黄芩苷、和厚朴酚在所选溶剂中的溶解情况
1.2.2 最佳处方的确定：通过考察防脱复合中药单体自微乳的稳定性来确定最佳处方[9]。①最佳Km 的确定：以辛基十二烷醇为油相，混合表面活性剂：PEG-40氢化蓖麻油，丙三醇，固定 Km （PEG40氢化蓖麻油：丙三醇）为2，绘制伪三元相图，根据文献[10]报道的方法，按质量比为 9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 精密称取油相与混合表面活性剂，混合均匀后，37℃条件下，恒温搅拌，并缓慢滴加蒸馏水，肉眼观察系统状态变化情况，记录相变点，用origin8.0绘制伪三元相图，并在此基础上绘制 Km 分别为 1、3的伪三元相图，用image-proplus软件计算其面积；②最佳油比例的确定：在确定最佳Km及预实验的基础上，选择油相为8%、12%、16%制备空白自微乳，4℃冰箱下放置24h，观察体系的浊度变化；③最佳载药量的确定：根据已有相关文献及预实验[10-12]，制备含活性物的自微乳，活性物的质量比：槲皮素：黄芩苷：和厚朴酚为1∶1∶1,选择活性物的总含量为10%，15%，20%，将制备好的自微乳放置4℃冰箱中24h，观察体系是否有沉淀析出。
1.2.3 防脱复合中药单体自微乳的制备：按照以上确定好的比例制备防脱复合中药单体自微乳，将活性物加入到辛基十二烷醇、混合表面活性剂中溶解，制得均一、透明的自微乳母液。
1.2.4 防脱复合中药单体自微乳粒径的测定：取2g防脱复合中药单体自微乳，稀释10倍后，用Zetasizer-nano-zs90测定粒径。
图1 不同Km值的三元相图
1.2.5 防脱复合中药单体自微乳稳定性的考察：按照《药物稳定性试验技术规范》，在不同温度下密闭保存观察是否分层、是否透明；若在不同温度下均不分层、透明则稳定。实验设计如下：取防脱复合中药单体自微乳置于透明塑料瓶中，4℃冰箱密封保存15d，在 0d、7d、15d时取样，观察其有无沉淀、分层和自乳化后微乳的性状及粒径；同样取防脱复合中药单体自微乳置于透明塑料瓶中，室温下密封避光保存3个月，在 0、1、2、3 个月时取样，观察其有无沉淀、分层和自乳化后微乳的性状及粒径。
1.3 防脱复合中药单体微乳凝胶剂的制备
1.3.1 防脱复合中药单体微乳凝胶剂的制备：将适量的卡波姆941撒于水中，充分溶胀后，用三乙醇胺调节pH值至7左右，搅拌均匀，制成凝胶基质，取2g防脱复合中药单体微乳加入已增稠好的卡波姆941至100g，搅拌至澄清透明，加入适量苯氧乙醇和羟苯甲酯，得防脱复合中药单体微乳凝胶。
1.3.2 防脱复合中药单体微乳凝胶粒径的测定：取2g防脱复合中药单体微乳凝胶，稀释40倍后，用Zetasizer-nanozs90测定粒径。
1.3.3 防脱复合中药单体微乳凝胶稳定性考察：本课题组借鉴《药物稳定性试验技术规范》对防脱复合中药单体微乳凝胶稳定性进行了初步考察，其中包括耐热实验、耐寒实验、常温实验。①耐热实验：将已制备好的微乳凝胶剂置于塑料瓶中密封后，放入（40±2）℃烘箱中，连续观察3个月，于0、1、2、3个月后取出，恢复室温，观察外观、涂展性、粒径、pH值和粘度的变化；②耐寒实验：将已制备好的微乳凝胶剂置于塑料瓶中密封后，放入（-15±2）℃冰箱中，连续观察3个月，于0、1、2、3个月后取出，恢复室温，观察外观、涂展性、粒径、pH值和粘度的变化；③常温实验：将已制备好的微乳凝胶剂置于塑料瓶中密封后，于室温下连续放样观察3个月，并于0、1、2、3个月时，取样观察凝胶剂外观、涂展性、粒径、pH值和粘度的变化。
2 结果
2.1 最佳 Km 值的确定：按照水滴定法绘制伪三元相图，当Km为1，2，3时，油与混合表面积的比为7∶3, 6∶4，5∶5，4∶6, 3∶7时，滴水的过程中能看到体系经历由浑浊变澄清或由澄清变浑浊，但9∶1, 8：2, 2∶8，1∶9这四个比例滴水的过程中观察到体系要么一直处于浑浊，要么一直是澄清，没有看到相变点。由水滴定法得到的5个相变点的实验数据经origin8.0和image-proplus处理，得到最佳的Km值,不同Km值的伪三元相图见图1，不同Km值面积占比见表2。由表2可知，当Km =2时的面积最大，面积越大形成的微乳区域就越稳定[13]，所以选择Km =2。
表2 各Km值的面积占比
2.2 最佳油的确定：已制备好空白的自微乳制剂在4℃冰箱下放置24h后，取出放置室温一段时间，只有含8%，12%油的自微乳体系依旧澄清，20%的处方体系由澄清变浑浊，鉴于油相是微乳形成的关键因素，不能过多，也不能过少[14]，所以最优空白自微乳处方：辛基十二烷醇：PEG-40氢化蓖麻油：丙三醇=12︰58.6︰29.4。
2.3 载药量的确定：已制备好的防脱复合中药单体自微乳在4℃冰箱下放置24h后，取出放置室温，含20%活性物的自微乳有沉淀析出，含10%，15%活性物的自微乳依旧澄清透明。从载药量的多少及稳定性考虑[12]，选择载药量为10%。初步得到最优处方组成为表面活性剂：助表面活性剂：油：药物为52∶26∶12∶10。
2.4 防脱复合中药单体自微乳粒径大小及分布图：利用Zetasizer-nano-zs90测得防脱复合中药单体自微乳粒径分布图见图2。
测得防脱复合中药单体自微乳粒径22.64nm，多分散性系数（PDI）0.145，微乳粒径大小分布比较集中时，PDI在0.3以下[15]，说明微乳粒径分布范围比较窄，粒径比较均匀。
2.5 防脱复合中药单体自微乳稳定性的考察：按照1.2.5设计好的实验方法考察防脱复合中药单体自微乳的初步稳定性结果见表3、4。由表3,4可知，在4℃和室温下密闭保存观察其均未分层、透明且稳定，加水自乳化后也澄清透明，淡黄乳光，测得的粒径大小也没有多大变化，说明此处方制备得的自微乳在低温和常温下稳定。
图2 防脱复合中药单体自微乳粒径分布图
表3 低温实验结果
表4 常温实验结果
图3 防脱复合中药单体微乳凝胶剂粒径分布图
2.6 防脱复合中药单体微乳凝胶剂粒径的测定：运用Zetasizer-nano-zs90测得防脱复合中药单体微乳凝胶粒径分布图见图3。由图3可知：测得防脱复合中药单体微乳凝胶剂的粒径42.87nm，PDI 0.238，说明微乳凝胶剂粒径分布范围比较窄，粒径比较均匀，但是还存在峰2、3，对于峰2可能是在稀释微乳凝胶剂时，卡波姆未分散均匀，有大颗粒肉眼看不见的卡波姆颗粒存在；至于峰3，可能是自乳化后的粒径较小的微乳颗粒未来得及与凝胶剂发生结合。
2.7 防脱复合中药单体微乳凝胶稳定性考察：按照1.3.3设计的实验方法，防脱复合中药单体微乳凝胶耐热、耐寒、常温实验结果见表5、6、7。由表5、6、7得，防脱复合中药单体微乳凝胶剂在耐寒，耐热，室温的条件下放置3个月，其pH值、粒径、外观、涂展性、粘度均没有多大的变化，得出此凝胶剂在适宜的环境中是稳定的。
3 讨论
3.1 由于目前还没有评价自微乳及微乳凝胶剂的完善方法，实验中参照《药物稳定性试验技术规范》对防脱复合中药单体自微乳和微乳凝胶剂稳定性进行考察，在设定的实验条件下，防脱复合中药单体自微乳澄清、稳定、均一，粒径大小几乎没有变化；微乳凝胶剂的pH、外观、粒径、涂展性及粘度也几乎没有什么变化。从上述稳定性试验可得本实验的自微乳处方可行，是一个良好的处方；由其制备得到的微乳凝胶剂稳定，涂展性好，为防脱制剂提供了一种新型的外用纳米制剂[16]。
表5 防脱复合中药单体微乳凝胶耐热随时间变化的实验结果
表6 防脱复合中药单体微乳凝胶耐寒随时间变化的实验结果
表7 防脱复合中药单体微乳凝胶剂随时间变化常温实验结果
3.2 提高脂溶性药物的水溶性有脂质体，囊泡体，醇质体等载体，本课题组选用制备简单，性质稳定，可提高药物生物利用度的自微乳，及将其制备成微乳凝胶剂，自微乳和凝胶技术相结合，既可利用微乳携带被包封的药物易于透过皮肤的特性，提高透皮效率；同时凝胶具有缓慢释放的特性，又可达到长效作用的效果。目前市面上用于治疗脂溢性脱发的皮肤外用制剂，存在刺激性大，透皮率低等缺点，本课题组研究的防脱复合中药单体微乳凝胶的目的是达到靶点确切，高效透皮吸收。高效的透皮吸收可能的机制如下[15,17]：①增加皮肤表皮角质层脂质双层流动性、破坏角质层水性通道、经毛囊吸收等途径，有效克服角质层对药物的屏障作用，从而将防脱成分送入真皮；②微乳结构的独特性，使其对脂溶性高效成分产生显着的增溶效应，从而使皮肤功效成分形成过饱和系统，大大增加皮肤内外药物的浓度梯度，从而提高防脱功效成分的透过量；③粒径的大小，药物经皮吸收的主要途径是角质细胞间质，而细胞间质一般在100nm以下，而普通的制剂粒径在几百微米以上，很难透过角质层到达作用靶点，本课题组研制的微乳凝胶剂粒径远小于100nm，能高效的将防脱复合成分运输进入皮肤作用于相应的靶点。
3.3 如此高效的透皮吸收是否会对皮肤造成刺激，需要做相关的实验来证明。但曾抗等研究了纳米乳对皮肤的刺激性，实验结果表明表面活性剂是产生皮肤刺激性的主要原因[18]，接下来，本课题组会进一步研究防脱复合中药单体微乳凝胶剂的体外安全性及有效性试验。
4 结论
本实验采用经典伪三元相图法结合考察自微乳的稳定性筛选出了最佳的自微乳处方，通过考察此处方制备的自微乳及其微乳凝胶剂的稳定性，得其均表现稳定，未出现分层、浑浊等现象，粒径均一且小于100nm。防脱复合中药单体自微乳及微乳凝胶制备工艺简单，性质稳定，粒径小，是一种有应用前景的高效透皮外用制剂。
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Research of self-microemulsion and microemulsion gel of anti-hair loss compound Chinese medicine monomer
LIU Cai-yun1,WANG Zhuo-ya1,LUO Xin-ru2,ZHANG Dai-rong2,LIANG Gao-wei3,WU Pei-cheng1
(1.College of Basic Science, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,Guangdong,China; 2.Guangzhou Land Biological Technology Co., LTD,Guangzhou 510000, Guangdong,China; 3.Guangzhou Tianwenjiaoyan Cosmetic Co., LTD, Guangzhou 510990,Guangdong,China)
Objective To study self-microemulsion and microemulsion gel of anti-hair loss compound Chinese medicine monomer, at the same time, its physical, chemical and stability performance are studied.MethodsScreened suitable oil phase, surfactant and cosurfactant, and water titration method was used to draw the ternary phase diagram, Screened the best of Km, also investigated the average particle size and stability of it. Results When Km is 2, and the suitable prescription is PEG-40 hydrogenated castor oil: glycerol: octyldodecanol: compound Chinese medicine monomer (52:26:12:10),the average particle size of self-microemulsion is 22.64 nm and it is stable in low and normal temperature, similarly, the average particle size of microemulsion gel is 42.87 nm and it is stable in tree different condition including heat resistant, hardy and normal temperature. Conclusion Self-microemulsion and microemulsion gel of anti-hair loss compound Chinese medicine monomer is a transdermal drug delivery system that have application prospect for simple of preparation technology, small size, good stability.
self-microemulsion; microemulsiongel; compound Chinese medicine monomer; transdermal drug delivery system; the optimum Km
R758.71
A
1008-6455（2016）12-0049-05
2016-08-10
2016-11-29
编辑/张惠娟
广东省科技特派员工作站资助项目(2014A090906013)
吴培诚，博士，副教授；主要研究方向：生物制药；E-mail∶pcwu@gdpu.edu.cn
刘彩云（1989-），女，湖南人，在读硕士研究生；E-mail∶1203575678@qq.com
