史敏 李娜 郭晓波 等
[摘要]目的：探讨miR-21对增生性瘢痕中PTEN表达和成纤维细胞增殖的影响，以期为增生性瘢痕的临床诊断和治疗提供新靶点。方法：分别用qPCR和Western blot检测增生性瘢痕（HTS）组织和细胞中miR-21及PTEN的表达;双荧光素酶报告基因检测验证miR-21与PTEN的调控关系;Western blot检测miR-21对增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）中PTEN蛋白表达影响;MTT检测细胞增殖能力变化。结果：HTS组织中miR-21高表达，PTEN低表达;双荧光素酶报告实验和Western blot证实了miR-21对PTEN的靶向调控作用;下调miR-21可增加PTEN的表达，从而可抑制PI3K/Akt通路活性，抑制HSF细胞增殖。结论：本研究证实了miR-21具有诊断和治疗HTS的潜能，并为临床提供可能的新靶点。
[关键词]miR-21;PTEN;增生性瘢痕;HSF;细胞外基质;PI3K/Akt
[中图分类号]R364.3+3 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2019）03-0092-03
Abstract： Objective To investigate the effect of miR-21 on PTEN expression and fibroblast proliferation in hypertrophic scar， in order to provide a new target for clinical diagnosis and treatment of hypertrophic scar. Methods The expression of miR-21 and PTEN in HTS tissues and cells were detected by qPCR and western blot， respectively. Dual luciferase reporter gene assay to verify the regulatory relationship between miR-21 and PTEN. Western blot analysis of the effect of miR-21 on the expression of PTEN protein in HSF cells. MTT assay for cell proliferation. Results High expression of miR-21 and low expression of PTEN in HTS tissues. Dual luciferase reporter assay and western blot confirmed the targeted regulation of miR-21 on PTEN. Down-regulation of miR-21 inhibits PI3K/Akt pathway activity and up-regulates HSF cell proliferation by up-regulating PTEN expression. Conclusion This study demonstrates the potential of miR-21 to diagnose and treat HTS and may provide new targets for clinical use.
Key words： miR-21; PTEN; hypertrophic scars; hypertrophic scar fibroblasts; extracellular matrix; PI3K/Akt
增生性瘢痕（hypertrophic scar，HTS）是临床常见的皮肤疾病，多见于烧伤、皮肤创伤及术后[1]，其治疗是一项棘手的问题。HTS不仅影响患者美观，易造成患者心理障碍，而且可引起身体机能受损甚至残疾。据统计，皮肤创伤后HTS的发病率可达40%～70%，而烧伤后更高达91%[2]。在皮肤伤口愈合过程中，成纤维细胞（fibroblast，FB）胶原分泌代谢过程受到严格调控，但在HTS形成过程中这种平衡状态被破坏，FB大量增殖，胶原过度合成、分泌，并沉积在细胞外基质（extracellular matrix，ECM），导致HTS形成[3]。虽然目前临床上HTS的防治有许多方法，但因其形成机制不明确，效果不佳。人们从分子水平探求抑制瘢痕成纤维细胞增殖机制，以寻找有效的治疗靶标，从而防止瘢痕形成。
瘢痕增生受多基因调控，目前已确定了部分瘢痕形成易感基因位点的表达调控，但机制不明确。微小RNA（microRNA或miRNA）是一类由18～22个核苷酸构成的微小非编码RNA，其广泛的基因调节功能已被证实在多种皮肤病中参与调节成纤维细胞增殖、分化和ECM合成过程[4-5]。据报道，在瘢痕疙瘩组织中miR-21高表达，可促进成纤维细胞胶原分泌及细胞增殖[6]。在多种纤维化疾病中已经证实miR-21显着高表达，如心肌、肾和肺纤维化[7]。PTEN是继P53后发现的另一肿瘤抑制基因，是PI3K/Akt通路公认的负性调节蛋白，在肿瘤中发挥抑癌因子作用。最近研究发现，瘢痕组织成纤维细胞PTEN表达低于正常皮肤成纤维细胞，且脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可降低正常FB中PTEN表达，提示PTEN表达增多可能会抑制HTS形成[8]。在肺癌组织中，miR-21可靶向抑制PTEN表达，从而促进肺癌细胞增殖侵袭[9]，然而miR-21是否通过靶向PTEN参与增生性瘢痕组织形成仍然未知，因此本研究将在人增生性瘢痕中揭示miR-21对PTEN作用关系和FB增殖的影响，从而为增生性瘢痕的临床诊断及治疗提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料：正常人皮肤成纤维细胞（GM0639）和人增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSF），提取试剂盒（mirVana? miRNA Isolation Kit）、miRNA逆转录试剂盒（TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit）及miRNA定量检测试剂盒（TaqMan? MicroRNA Assays）、LipofectamineTM 2000脂质体均购自Invitrogen公司;总RNA提取试剂RNAiso Plus、qPCR试剂盒（SYBR?Premix Ex TaqTM）均购自TaKaRa;Dual Luciferase?Reporter Assay System购于Promega公司;RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物;胎牛血清、RPMI1640、Opti-MEM、青链霉素购自Gibco公司;PTEN购自CST;GAPDH和HRP标记二抗购自中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 标本收集：收集2015年2月-2018年2月陕西省西安市中心医院患者手术切除的增生性瘢痕组织及邻近正常皮肤组织，取材前得到患者本人或家属签署的知情同意书，患者在手术前1年内未接受任何治疗，并且无系统性疾病，无肿瘤病史。经术后病理检查均证实为增生性瘢痕组织，其中男42例、女25例，所有取材操作均经医院伦理委员会批准。
1.3 qPCR检测：用miRNA提取试剂盒（mirVana? miRNA Isolation Kit）提取总miRNA，酶标仪测定miRNA浓度，按照miR-21逆转录试剂盒（TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit）及miR-21定量检测试剂盒（TaqMan?MicroRNA Assays）检测miR-21的相对表达水平，以U6为内参;用RNA提取试剂RNAiso Plus提取总RNA，酶标仪测定总RNA浓度，按照qPCR试剂盒（SYBR?Premix Ex TaqTM）进行PTEN定量检测，以GAPDH为内参。引物如下，PTEN引物：CATCCTGCAGAAGAAGCC和TGCTTTGAATCCAAAAACCTTA;GAPDH引物：GTGGGCATCAATGGATTTGG和CACCATGTATTCCGGGTCAAT，用2-ΔΔCt法计算PTEN和miR-21相对表达情况。
1.4 Western blot检测：将处理细胞加裂解液裂解，12 000g离心15min，BCA法进行蛋白定量。取适量蛋白加上样缓冲液配制蛋白样品，95℃变性后使用10% SDS-PAGE电泳分离并转至PVDF膜上，PTEN和GAPDH一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜2次，加二抗稀释液室温孵育2h，TBST洗膜2次，于暗室中用化学发光液ECL对条带进行曝光显影，Image J软件测蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算各个蛋白相对表达量。本步骤重复3次。
1.5 双荧光素酶报告实验：使用PCR扩增PTEN并克隆到pmirGLO构建报告载体，用Stratagene点突变试剂盒突变pmirGLO-PTEN-WT上miR-21结合位点，构建pmirGLO-PTEN-Mut报告载体。将质粒miR-21或miR-NC转染至293T细胞，48h后用Dual Luciferase?Reporter Assay System试剂盒检测各组细胞海肾荧光素酶活性。
1.6 细胞培养：GM0639和HSF培养于10%胎牛血清的RPMI1640培养液，293T细胞培养于10%胎牛血清的DMEM中，细胞均放置于含5% CO2、37℃的培养箱。转染前先进行细胞传代，次日待有40%的融合度再进行培养。根据处理方法的不同，将HSF细胞分为空白对照组（Blank组）、阴性对照组（miR-NC组）和miR-21 Inhibitor组。
1.7 MTT检测细胞增殖：将处理后的细胞接种于96孔板，每组设置3个复孔，采用MTT法测贴壁细胞不同时间点的活力。每孔加入5mg/ml MTT 20μl，37℃培养4h弃去培养液，各孔加入150μl DMSO，室温、避光摇床震荡12min，充分溶解结晶物。以空白孔为对照，酶标仪检测490nm波长处吸光度值，以吸光度值大小反映细胞增殖能力，每组实验重复3次。
1.8 统计学分析：采用SPSS 20.0进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（x?±s）表示，两组数据采用独立样本t检验，多组差异比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-21在增生性瘢痕组织中表达：经qPCR检测发现，与正常皮肤组织相比，miR-21在增生性瘢痕组织中表达明显增加（P<0.01），见图1。
2.2 PTEN在增生性瘢痕组织中表达：Western blot检测发现，与正常皮肤组织相比，增生性瘢痕组织中PTEN表达显着降低（P<0.01），见图2。
2.3 miR-21对PTEN表达的影响：应用miR-21、miR-21模拟物，阴性对照瞬时转染后检测发现，miR-21与miR-NC相比，转染miR-21后HSF内源性miR-21表达显着下降（P<0.01），（见图3）;而PTEN显着增加（P<0.01），（见表1）。因此，miR-21可靶向抑制PTEN的表达。
2.4 miR-21对HSF增殖能力的影响：MTT检测转染miR-21抑制剂后对HSF增殖能力影响。结果可见，与miR-NC相比，下调miR-21后第2天、第3天可显着抑制HSF增殖能力（P<0.01）。由此可知，下调miR-21可通过PTEN进而抑制HSF增殖能力。见图4。
3 讨论
HTS是皮肤创伤后组织自我修复过度的异常愈合结果，组织学表现为FB大量增殖和胶原分泌及ECM过度聚集沉积。HTS的发病机制和防治一直是长期困扰整形外科的难题之一。由于瘢痕形成机制复杂、影响因素广泛，至今尚不明确，因此治疗缺乏针对性，目前临床上常规的治疗方法较多但效果差强人意。
瘢痕增生发病机制研究的开展已深入到细胞、分子和基因水平，部分瘢痕易感基因位点已被确定，且已证实PI3K/Akt、TGF-β-smads信号途径、MAPK均参与了瘢痕增生的形成。近期研究表明，在人体组织中FB的增殖、分化和ECM合成中都有miRNA的参与调节。已经证实，miR-21在器官纤维化疾病中存在高表达[10-11]，且参与了纤维化疾病的发生发展。张奇[12]对创伤愈合研究表明，HTS组织中miR-21表达量显着增高，进而促使TGF-β表达，导致胶原和ECM的过度沉积和HTS形成。研究表明[13]，miR-21可通过靶向Smad7促进增生性瘢痕形成，促进细胞外基质合成，慕生枝等[14]经下调miR-21通过PDCD4抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖。彭燕[15]在体外培养人增生性瘢痕FB的研究表明，与正常皮肤相比，人增生性瘢痕FB中的miR-21、TGF-β1表达显着升高，miR-21与TGF-β1呈正相关。在本研究中，笔者也证实，与正常皮肤组织相比，miR-21在HTS组织中显着低表达，这与彭燕等的研究结果一致。
PTEN基因定位于10q23.3，其编码的蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，它是迄今为止发现的第一个具有双重磷酸酶活性的抑制基因。PTEN通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt、MAPK细胞外信号调节激酶（ERK）途径抑制肿瘤细胞分化、周期停滞及细胞凋亡，从而发挥抑癌的关键性作用[16]。研究表明，PTEN突变或缺失与多种癌症如胃癌、肺癌等发生有关[17]。研究发现，PTEN在特发性肺纤维化组织及风湿性关节炎滑膜组织的成纤维细胞中低表达，而过表达可抑制纤维化肺组织中FB的增殖并诱导其凋亡[18]。最近报道，瘢痕组织FB中PTEN表达低于正常皮肤，且LPS可降低正常FB中PTEN表达[8]，提示提高PTEN表达则可能抑制HTS形成。生物信息学及文献报道证实，miR-21对器官、组织及FB的增殖和ECM合成具有显着调节作用，说明miRNA对瘢痕增生的作用可能是多因素综合所致。本研究也证实了在正常皮肤组织和HTS组织中miR-21的表达存在显着差异，HTS组织中miR-21的表达显着增高而PTEN低表达，下调miR-21后PTEN表达升高，且miR-21可抑制FB增殖。然而miR-21和PTEN的作用模式，诸如靶基因的预测和验证仍需进一步研究。
综上所述，miR-21是HTS形成的重要调节因子之一，临床上可通过抑制miR-21来诊断治疗HTS。
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[收稿日期]2018-12-24
本文引用格式：史敏，李娜，郭晓波，等.miR-21调控PTEN/PI3K/Akt通路抑制增生性瘢痕形成的机制研究[J].中国美容医学，2019，28（3）：92-95.
