荧光探针在自噬检测中的应用

袁媛 徐翠萍 张吉甜

(山东第一医科大学附属省立医院，山东 济南 250000 1 临床营养科； 2 肺功能室)

自噬(autophagy)是细胞中一种进化保守的生命现象,其主要作用是清除和降解自身受损的细胞器以及多余的生物大分子,并利用降解产物提供能量和重建细胞结构,对维持细胞稳态和生命活动有重要意义[1]。自噬根据底物进入溶酶体的途径不同一般分为3类：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。巨自噬发生时，在内质网或高尔基体周围形成一个小的类似“脂质体”样的双层膜碗口状结构，被称为phagophore。当phagophore不断延伸，将胞浆中衰老的细胞器、折叠错误的蛋白等全部揽入“碗”中，然后“收口”，从而成为密闭球状的autophagosome，即“自噬体”。然后，自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，即自噬溶酶体，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，自噬体中的“货物”也被降解，产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中[2]。自噬参与调节许多生理过程，包括营养素剥夺、围着床期胚胎发育、能量缺失、氧化应激等，并参与多种疾病如糖尿病、糖尿病肾病、阿尔茨海默症、骨性关节炎及多种肿瘤性疾病的发生发展过程[3-5]。

自噬的静态检测方法众多，包括利用电子透射显微镜直接观察不同阶段的自噬结构，或基于免疫印迹实验检测自噬相关蛋白的表达，缺点是自噬具有多态、多步骤、动态的特点，某一时间点的自噬检测不足以客观反映自噬活性。现阶段通常以自噬通量作为自噬水平的度量标准，包括底物从被自噬体包裹到运至溶酶体降解的全过程。自噬通量的检测中，荧光探针具备可视化、可定量、染色简便、细胞毒性低、设计灵活等特点，应用极为广泛[6]。在此，本文总结了当前常用及新型探针的设计原理、优点及不足、应用范围等，以便在自噬研究中合理应用。

1 微管相关蛋白轻链3(LC3)标记荧光探针检测自噬通量

LC3是自噬检测的一个热门靶点，其泛素化样结合于自噬体的双层膜结构，是定位于自噬体的独特修饰物。LC3由proLC3合成，proLC3的羧基末端被半胱氨酸蛋白酶切割，以暴露其羧基末端甘氨酸残基Gly，形成LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ经过剪切和泛素化修饰过程，与自噬体双层膜结构的磷脂酰乙醇胺和(或)磷脂酰丝氨酸(PE)结合形成LC3-磷脂缀合物(LC3-Ⅱ)，定位于自噬体[7-9]。随着自噬体与溶酶体融合，自噬体胞质面上的LC3-Ⅱ被Atg4B脱脂形成LC3-Ⅰ，进入再循环，而自噬体腔表面上的LC3-Ⅱ被溶酶体水解酶降解。因此，LC3是一种很有前景的自噬体标记物，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换及LC3-Ⅱ的降解，可区分自噬体数量和降解活性，并确定自噬过程是否已到达降解步骤[10]。

1.1 单荧光标记蛋白(FP)-LC3s

一般情况下，FP-LC3s，例如GFP-LC3、EGFP-LC3、YFP-LC3、CFP-LC3、RFP-LC3、mCherry-LC3和HcRed-LC3等，弥散分布在细胞质内，自噬被诱导时，FP-LC3被脂化并定位于自噬体和自噬溶酶体，形成荧光斑点，但利用荧光显微镜技术计量荧光斑点和强度并不能反映自噬通量的大小。因为斑点的聚集既可能是自噬被诱导，也可能是下游通路如自噬体和溶酶体融合障碍，或者是溶酶体内酶降解缺陷所致。因此，FP-LC3s在应用时一般需要加溶酶体抑制剂作为对照，溶酶体降解的抑制可以导致FP-LC3斑点进一步增加，表示自噬通量增加。此外，C端甘氨酸突变的LC3ΔG，因为不能被Atg4切割，不能转化为LC3-Ⅱ，也可作为阴性对照。

利用荧光显微镜通过观察FP-LC3检测自噬的局限性主要为，生理性自噬时FP-LC3也会形成少量的荧光斑点，难以和诱导性自噬相区分；另外，在FP-LC3质粒转染过程中若过表达，自身容易发生聚集，使自噬通量被高估。此时，可以设立C端甘氨酸突变的FP-LC3ΔG对照，因其不能被Atg4切割，不能转化为LC3-Ⅱ，可作为阴性对照组。另外，自噬诱导剂如巴非霉素A1、氯喹或蛋白酶抑制剂可能引起附加效应，比如中和或抑制溶酶体酶可抑制mTOR，诱导自噬[11-12]；氯喹可以促进除自噬诱导外的LC3-Ⅱ形成[13]，并且氯喹、秋水仙碱和亮蛋白等溶酶体抑制剂对不同组织(器官)的作用似乎不同，精确检测LC3-Ⅱ需要合理选择溶酶体抑制剂作为对照[14]。

应用流式细胞术检测FP-LC3荧光蛋白的强度分析自噬通量时，一般应用皂素使细胞破膜，使水溶性LC3-Ⅰ洗脱，定位于自噬体膜的脂溶性LC3-Ⅱ则仍保留在细胞内。此时联用自噬抑制剂并应用流式细胞术进行分析，即可区分FP-LC3-Ⅱ荧光强度的增加是自噬通量增强还是自噬下游抑制所致。

另外，还可以应用Western-blot实验对荧光蛋白抗体进行检测。如GFP-LC3-Ⅱ进入溶酶体以后，LC3-Ⅱ会被酶解，GFP则被保留。应用GFP抗体可以检测到GFP-LC3-Ⅰ、GFP-LC3-Ⅱ及GFP 3条免疫印迹。其中，游离GFP条带表示自噬通量活化。同时，也应当使用自噬抑制剂作为对照，可避免GFP被自噬过度活化水解出现假阴性。

1.2 双荧光串联探针(Tf)-LC3

在FP-LC3应用中发现，EGFP-LC3发出的绿色荧光在溶酶体酸性条件下发生荧光衰减或猝灭，mRFP-LC3发射的红色荧光在自噬溶酶体酸性环境中相对稳定。这种差异是由EGFP-LC3和mRFP-LC3的解离常数pKa(EGFP的pKa 5.9，mRFP的pKa 4.5)决定的[15]。pKa越高，在溶酶体等酸性囊泡中越容易发生荧光猝灭。由此，一种新型单分子双荧光串联蛋白标记的mRFP-EGFP-LC3探针开始用于监测自噬体成熟过程[15]。mCherry-EGFP-LC3、mKate2-EGFP-LC3荧光探针均属于此类Tf-LC3探针[16]。一般情况下，Tf-LC3的绿色和红色双阳性荧光呈黄色弥散分布在细胞质(pH 7.4)中，自噬诱导时，Tf-LC3分别定位于自噬体和自噬溶酶体(pH 4～5)，呈现黄色荧光斑点和红色荧光斑点。自噬诱导时，黄色荧光斑点和红色荧光斑点数目均增加，当自噬体与溶酶体融合被抑制时，导致黄色荧光斑点增加，红色荧光斑点降低。因此，可以通过计算红色和黄色荧光斑点的比例判断自噬通量的强弱。

在自噬研究中，Tf-LC3探针主要用来示踪自噬体的成熟过程，可以通过激光共聚焦显微镜、流式细胞术和活细胞工作站进行检测。

当使用Tf-LC3探针检测自噬时，绿色荧光蛋白有较高的pH敏感性，在溶酶体内完全猝灭，是灵敏区分自噬体和自噬溶酶体、监测自噬体成熟步骤的关键[17]。基于此原理，pHlurorin-mKate2-LC3以及mTagRFP-mWasabi-LC3探针应运而生，其中pHlurorin(pKa 7.6)pH敏感度高于mWasabi(pKa 6.5)和EGFP(pKa 5.9)[17-19]，在溶酶体内猝灭更完全，检测自噬的灵敏度更高。

Tf-LC3探针的局限性体现在，当其转移至溶酶体时，虽然RFP比GFP更稳定，但是最终仍然会被降解[20]。故选择pH更加稳定的红色荧光蛋白，如mKate2、mCherry可以相对提高结果的准确性。此外，与RFP串联，GFP信号强度会因荧光再吸收或荧光共振能量转移而降低，同时自噬诱导改变了RFP随LC3在细胞内的分布，也会影响用荧光显微镜进行比率分析的精确度。因此，Tf-LC3探针更适宜于检测个体自噬结构的成熟过程。进一步联合红外标记的溶酶体探针则可以进一步研究自噬小体、自噬溶酶体、溶酶体三者的动态变化。

1.3 双荧光内对照探针GFP-LC3-RFP-LC3ΔG

GFP-LC3-RFP-LC3ΔG双荧光内对照探针可以将GFP-LC3融合到缺失C末端甘氨酸的RFP-LC3ΔG的N末端，可用于定量评估自噬通量。在胞质中，ATG4B在LC3的C末端甘氨酸后切割肽键[8]，将GFP-LC3-RFP-LC3ΔG分离为等摩尔量的GFP-LC3和RFP-LC3ΔG。GFP-LC3与PE缀合并定位于自噬体。与溶酶体融合后，自噬体内膜上的GFP-LC3被降解，外膜上的GFP-LC3被ATG4蛋白解耦联并再循环回到胞质溶胶当中。RFP-LC3ΔG因C末端甘氨酸缺乏不能进行脂质化，故不参与自噬过程，稳定存在于细胞质中，作为内部对照。自噬通量的高低由GFP/RFP荧光信号比表示。GFP/RFP比值高，自噬活性弱；比值低，自噬活性强。

笔者前期的研究发现，GFP-LC3-RFP-LC3ΔG在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠胰岛β细胞(min6)、大鼠胰岛素细胞(INS-1)、小鼠胰岛β细胞瘤细胞(β-TC3)体外细胞实验中均可稳定表达。作为单分子探针，在细胞质被切割成等摩尔量的GFP-LC3(自噬底物)和RFP-LC3ΔG(内部对照)，与Tf-LC3探针相比不改变RFP在细胞内的分布，避免了RFP在溶酶体酸性坏境下的微弱降解，精确度更高。此外，以RFP-LC3ΔG作为内部对照，相对于单荧光FP-LC3s，除不需要额外设立溶酶体抑制剂对照组外，还可以确定GFP强度的降低是因自噬增强，还是因LC3合成和(或)细胞数量的减少所致。因此，此探针非常适用于药物高通量筛选，因为药物本身毒性就会造成细胞的活力降低以及自身LC3合成减少而导致GFP荧光强度的降低。KAIZUKA等[21]应用此探针重新检测了1 054种药物，鉴定出13种新型诱导剂和18种新型抑制剂，并且此探针确定的43种抑制剂中有6种之前被定义为自噬诱导剂。另外，此探针不但可以进行体外细胞的自噬监测，还可以对活体生物体内基础自噬进行监测，如监测斑马鱼受精卵着床期自噬活性；通过构建表达GFP-LC3-RFP-LC3ΔG的转基因小鼠，可以用来监测生理状态下不同器官以及组织的基础自噬水平[22]。在此基础上，2020年YAZAWA等[22]构建了更敏感的pHluorin-LC3-mCherry内对照探针，并且结合CRISPR/Cas9技术成功应用于小鼠全基因组gRNA筛选。综上所述，新型内对照荧光探针GFP-LC3-RFP-LC3ΔG可应用免疫荧光显微镜、流式细胞仪、活细胞工作站等技术检测自噬水平，适用于高通量筛选和测量体内基础、病理状态及药物干预后的自噬水平。

GFP-LC3-RFP-LC3ΔG探针整合到慢病毒基因组转染细胞时，LC3和LC3ΔG容易发生同源重组，需通过克隆筛选避免无法降解的GFP-LC3ΔG出现[21]。所以单纯定量监测自噬通量，可用GFP-LC3-RFP作为替代，不影响结果准确性，但无法示踪细胞质LC3的翻译后修饰过程[23-24]。此外，相比GFP-LC3在饥饿诱导自噬时30 min就能形成荧光斑点，此探针2～4 h才能观察到明显的GFP/RFP比率降低，时效性不足。另外，动物体内各种细胞、组织探针表达水平存在差异，导致比率变化可能会不一致。

2 溶酶体途径相关荧光标记蛋白

2.1 双激发峰荧光染料Keima

Keima是一种pH敏感、双激发比率荧光蛋白，具有溶酶体蛋白酶的抗性。Keima在波长620 nm处具有发射峰，同时具有pH值依赖的双激发峰。在细胞质中性pH条件下，Keima在波长440 nm位置具有激发峰，并且在溶酶体酸性区室中其激发峰移至波长550 nm位置。因此，可以通过在波长550 nm/440 nm处激发的信号强度比率计算随时间从胞浆递送至溶酶体的Keima的量。Keima应用时常与目标蛋白质或者细胞器靶向肽融合，以监测特定蛋白质或者细胞器的定位，多是用于评估选择性自噬[25]。比如，将Keima融合到细胞色素C氧化酶Ⅲ序列当中后可构建线粒体靶向Keima的mt-mKeima[26-27]；把Keima定位在核糖体上，可研究核糖体自噬情况[28]。

微自噬可以直接将Keima从细胞质转运到溶酶体并导致波长550 nm/440 nm处激发的信号强度比率增加[25]，而不经过自噬体形成阶段。因此，要精确测量Keima的波长550 nm/440 nm处激发的信号强度比率的变化是否完全为自噬体-自噬溶酶体的途径自噬，应当同时测定Keima和巨自噬标记蛋白，如LC3/p62。此外，Keima具有溶酶体酸性依赖性，因此不能用来测评固定后的细胞和组织。

2.2 酸性依赖荧光染料LysoTracker与DQ-BSA

LysoTracker在酸性环境下发出荧光[29]，可示踪活细胞溶酶体。DQ-BSA是荧光蛋白酶底物衍生的牛血清白蛋白，被溶酶体、自噬溶酶体等酸性区室内的蛋白酶消化后释放荧光[30]，可示踪溶酶体和检测溶酶体功能是否正常。AHSAN等[31]应用此探针验证了番茄红素可通过改善溶酶体功能促进自噬，从而发挥对缺血性神经元损伤的保护作用。两者通常联合LC3巨自噬标记物或其他选择性自噬探针，通过荧光显微镜或流式细胞仪检测自噬通量。

2.3 线粒体特异性双激发/发射波长(ex/em)荧光染料HQO

线粒体自噬通常使用定位于线粒体和自噬体/溶酶体的荧光共定位方法评估。HQO是一种常用于评估线粒体自噬的花青色染料，毒性小，具有pH依赖的双(ex/em)波长，其可以特异性地积聚在活细胞的线粒体内。在线粒体内，pH为中性情况下，ex/em波长为530 nm/650 nm时，呈绿色。当线粒体呈递到溶酶体后，HQO被质子化为HQOH+，并且其ex/em波长移至710 nm/750 nm时，呈红色。因此，HQOH+/HQO荧光发射比率可用于测定线粒体自噬通量的大小。而激光共聚焦显微镜可以通过荧光颜色变化示踪线粒体自噬的过程。HQO可以选择性聚集在线粒体内，且质子化前后斯托克位移大于100 nm，无需与其他探针分子联用即可特异性地检测线粒体自噬通量。但HQO和Keima一样均具有pH依赖性，不可以用来测定固定后的细胞和组织。

2.4 阳离子双亲荧光染料Cyto-ID

Cyto-ID是一种阳离子双亲荧光示踪染料，与LysoTracker或DQ-BSA相比，Cyto-ID可特异性标记自噬囊泡，而不对酸性溶酶体或自噬溶酶体区室染色，可以灵敏地区分巨自噬和微自噬，其与溶酶体抑制剂如BAF和CQ联合使用，可以评估自噬通量[32]。Cyto-ID适用于荧光显微镜、流式细胞仪和分光光度计检测技术，多用于RNAi筛选和小分子药物高通量筛选，在开发自噬相关疗法和监测自噬调节药物效果方面具有较高的应用价值。

2.5 溶酶体极性依赖荧光染料Lyso-OC

溶酶体和自噬溶酶体具有不同的极性。双光子荧光探针Lyso-OC由极性依赖性荧光香豆素和溶酶体靶向的吗啉组成，可特异性标记活细胞溶酶体。Lyso-OC在波长760 nm处双光子激发之下，在溶酶体中发射490～550 nm的亮绿色荧光。当溶酶体和自噬体融合后，具有极性依赖性的香豆素荧光淬灭为浅绿色。

Lyso-OC探针几乎没有细胞毒性，在MCF-7细胞、HeLa细胞、HELF细胞和CHO细胞等多种细胞系中显示出良好的适用性，通过激光共聚焦成像可实时监测活细胞自噬过程，也可用流式细胞术做高通量筛选。但在使用过程中应排除其他细胞过程及溶酶体营养因子、自噬诱导剂和抑制剂对溶酶体极性的影响[33],且要区分微自噬和巨自噬，还应同时检测其他自噬标记蛋白，如LC3/p62等。

总之，自噬参与调节多种生理和病理过程，为当前科研工作的热点[3-5]。因其呈多步骤、动态性，自噬通量的准确检测也是科研工作的难点。当前，以自噬标记性蛋白LC3和溶酶体依赖性探针为代表的荧光探针在自噬检测中广泛应用[6]。探针研发也从单荧光蛋白探针发展到双荧光蛋白探针、含自身内对照的新型双荧光蛋白探针以及特异性定位不同细胞器以检测选择性自噬的荧光探针；从体外实验的荧光探针发展到通过转基因技术在动物模型中表达以检测在体自噬的探针。但每种探针均有其优点和不足。国内外自噬研究中均有因为没有考虑到所使用探针的局限性使自噬检测不够精准，甚至因探针构建、选用等问题造成结果难以解释或者谬误。

因此在自噬研究中，不仅要根据各荧光探针的适用范围和实验目的进行合理选择，往往还要根据实验条件和目的在多个时间点和步骤，联合应用多种检验和分析方法进行检测，如利用电子显微镜检测特定时间点自噬结构、利用免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3、P62的表达，同时应合理设置对照组以及联用自噬诱导剂和抑制剂等，这样才能更准确和更全面地反映细胞的自噬强度。