解宸一 杨亚楠 王硕 赵万东 吕志远 宋静宜 何宁宁
［摘要］ 目的 探讨生长因子受体结合蛋白2（GRB2）基因在肾癌中的表达及其对患者预后的影响。方法挖掘ONCOMINE数据库中肾癌GRB2基因相关数据进行基因表达分析，结合在TCGA数据库中挖掘的GRB2基因在肾癌组织和正常组织中的表达差异，获得GRB2基因的表达与患者预后的关系。并通过STRING数据库，构建GRB2基因的蛋白质-蛋白质互作网络图。采取实时荧光定量PCR的方法检测6例肾癌组织及其癌旁正常组织中GRB2基因的相对表达量。结果 与正常肾组织相比，GRB2基因在肾癌组织中的表达明显升高，差异具有统计学意义（t=8.21，P<0.05），GRB2基因在肾癌组织中的表达升高与肾癌患者预后相关（z=2.71，P<0.05）。进一步对GRB2相关的14个相互作用蛋白进行分析显示，GRB2主要参与了细胞的增殖和凋亡过程。肾癌组织中GRB2基因相对表达量显着高于其癌旁正常组织（t=6.98，P<0.001）。结论 GRB2基因在肾癌组织中高表达，且其基因表达水平与肾癌患者的预后明显相关。
［关键词］ 肾肿瘤；GRB2衔接蛋白质；预后；基因表达谱；蛋白质相互作用图；数据库，遗传学；数据挖掘
［中图分类号］ R737.11 ［文献标志码］ A
［ABSTRACT］ Objective To investigate the expression of the growth factor receptor-bound protein-2 （GRB2） gene in renal carcinoma and its influence on prognosis. Methods The ONCOMINE database was used to obtain the data on the expression of the GRB2 gene in renal carcinoma， and the TCGA database was used to analyze the difference in the expression of the GRB2 gene between renal carcinoma tissue and normal tissue， as well as the association between the expression of the GRB2 gene and the prognosis of patients. The STRING database was used to construct the protein-protein interaction network of the GRB2 gene. Quantitative real-time PCR was used to measure the relative expression level of the GRB2 gene in six renal carcinoma tissue samples and corresponding adjacent normal tissue samples. Results The expression of the GRB2 gene in renal carcinoma tissue was significantly higher than that in normal renal tissue （t=8.21，P<0.05）， and the increased expression of the GRB2 gene in renal carcinoma tissue was associated with the prognosis of renal carcinoma （z=2.71，P<0.05）. Further analysis of the 14 GRB2-related interacting proteins showed that GRB2 was mainly involved in cell proliferation and apoptosis. The relative expression level of the GRB2 gene in renal carcinoma tissue was significantly higher than that in the corresponding adjacent normal tissue （t=6.98，P<0.001）. Conclusion The GRB2 gene is highly expressed in renal carcinoma tissue， and its expression level is significantly asso-ciated with the prognosis of patients with renal carcinoma.
［KEY WORDS］ Kidney neoplasms; GRB2 adaptor protein; Prognosis; Gene expression profiling; Protein interaction maps; Databases， genetic; Data mining
肾癌是一种常见的致死性泌尿系统疾病[1]，发病人群主要集中在50～60岁[2]，并且男性更为多发，约为女性发病率的2倍[3]。由于多数肾癌被发现时已经处于晚期，失去了最佳的治疗时机，故而早期发现、早期治疗非常重要。
生长因子受体结合蛋白2（GRB2）是一种在细胞中广泛表达的衔接蛋白，作为细胞信号通路的重要节点蛋白在细胞内的众多信号传导通路中发挥着重要的调控作用[4-5]。GRB2高表达可影响生长因子家族成员的激活，促进癌细胞 DNA 扩增，导致患者癌细胞扩散或者转移风险的增加[6-7]。研究证明，GRB2主要在MAPK信号转导过程中起作用，通过级联Ras-Raf-MAPKK-MAPK通路，调控细胞增殖和分化[8-11]。这些信号通路的活动对正常个体发育及成熟稳定是至关重要的，当这些通路存在异常或受到干扰时易导致肿瘤的发生[12-13]。既往研究显示GRB2基因与肿瘤的发生发展有关[14]，但关于GRB2基因在肾癌中表达的情况尚不清楚。
本研究利用ONCOMINE数据库和TCGA数据库分析人GRB2基因在肾癌患者中的表达情况，通过建立GRB2的蛋白质-蛋白质相互作用网络，挖掘与肾癌密切相关的重要蛋白质，为进一步研究GRB2基因在肾癌发生发展中的机制提供线索和思路。
1 材料和方法
1.1 检索GRB2基因在所有肿瘤类型中表达情况
利用ONCOMINE数据库（https：//www.oncomine.org，版本4.5）检索GRB2基因在肿瘤患者中表达的研究数据，检索条件设定为：①P<0.05;②倍数变化≥1.5;③使用全部的基因排序，记录GRB2在20种肿瘤中的表达情况。
1.2 比较GRB2基因在正常组织和肾癌组织中的差异表达情况
利用ONCOMINE数据库检索GRB2在正常肾组织和肾癌组织中表达的所有研究数据，进行汇总分析后，筛选出GRB2在正常组织和肾癌组织中的差异表达情况。
1.3 分析GRB2表达与肾癌患者预后的关系
登录cBioportal在线分析工具（www.cBioportal.org）中的TCGA数据库，研究类型选择为“肾癌”，基因资料（阈值设定为2.0）为“mRNA Expression z-score”，检索词为“基因GRB2”，结果输出时选择“Survival”，绘制Kaplan-Meier生存曲线。根据Kaplan-Meier分析中基因表达量的中位数进行分组，分为高表达组和低表达组，用以分析GRB2基因表达和肾癌患者预后的相关性。
1.4 构建GRB2蛋白质-蛋白质互作网络
通过蛋白质-蛋白质相互作用数据库STRING（https：//string-db.org/），以“实验数据”作为证据来源，构建GRB2蛋白互作网络图。对筛选出的互作蛋白再通过KEGG通路分析预测其生物学功能。
1.5 实时荧光定量PCR检测肾癌及其癌旁正常组织中GRB2的表达
选取青岛大学附属医院2020年1月—2022年12月确诊为肾癌的6例患者手术切除的癌组织和癌旁正常组织标本各100 mg，加入1 mL的Trizol试剂，研磨成组织匀浆以后提取总RNA。利用逆转录试剂盒提取cDNA，GRB2基因以及内参照基因GAPDH的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（GRB2正向引物：5′-CCTGGACTTAGC-ATTGTGAG-3′，反向引物：5′-TTATCATCAGC-AGGGAGAGC-3′；GAPDH正向引物：5′-GGTT-GTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向引物：5′-TGGT-CCAGGGTTTCTTACTCC-3′）。利用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的PCR试剂盒进行PCR反应。采用2－△△CT法计算基因的相对表达量。实验重复3次，实验结果取均值。本研究通过了青岛大学医学部伦理委员会审批（QDU-HEC-2022250）。
1.6 统计学分析
正常组织与肾癌组织GRB2基因表达比较采用t检验，采用Kaplan-Meier法计算GRB2基因表达与肾癌预后的关系。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 GRB2基因在所有类型肿瘤中的表达情况
在ONCOMINE数据库中共检索到GRB2基因在不同类型肿瘤中表达情况的研究结果446个，其中有80个研究结果显示GRB2基因在乳腺癌、白血病、淋巴癌、头颈部癌等肿瘤组织中高表达，29个结果显示GRB2基因在白血病和淋巴癌等肿瘤组织中低表达（图1）。图中蓝色方框中数字表示显着低表达的研究结果数量，红色方框中数字表示显着高表达研究结果数量。在ONCOMINE数据库中，检索到9个关于GRB2在正常组织和肾癌组织表达的研究结果，共包含376例样本。其中在肾癌的统计结果中，有7个结果显示GRB2基因在肾癌组织中高表达（R2=2.65，P<0.05）。见图1。
2.2 GRB2在正常组织和肾癌组织中的表达情况比较
进一步对ONCOMINE数据库中的GRB2基因在正常肾组织和肾癌组织中的表达情况进行分析。其中肾癌（肾乳头状肾细胞癌）组织中GRB2基因的表达水平明显高于正常肾组织（胎儿肾组织或者正常肾组织），且差异具有统计学意义（差异倍数为1.857，t=8.21，P<0.05）。肾癌（肾透明细胞癌）组织中的GRB2基因表达水平也明显高于正常肾脏组织，且其差异具有统计学意义（差异倍数为1.593，t=9.54，P<0.05）。
2.3 GRB2表达与肾癌患者预后的关系
通过cBioportal在线分析工具中的TCGA数据库，利用Kaplan-Meier生存曲线验证GRB2表达水平与肾癌患者预后的关系。结果显示，GRB2高表达组（n=133）患者的生存率低于GRB2低表达组（n=398），差异具有显着性（z=2.71，P<0.05）。
2.4 构建GRB2的蛋白质-蛋白质互作网络
通过STRING数据库构建GRB2蛋白质-蛋白质互作网络图，发现钙调神经磷酸酶B类蛋白质（CBL）、表皮生长因子受体（EGFR）、人SHC-转化蛋白1（SHC1）、son of sevenless 1（SOS1）和GRB2关联结合蛋白2（GAB2）5种蛋白与GRB2直接相关（图2）。进一步对图2中的GRB2蛋白质-蛋白质互作蛋白进行KEGG通路分析，发现这些蛋白主要参与了细胞增殖和凋亡调控相关的通路（ERBB信号通路和EGFR信号通路）。
2.5 GRB2基因在肾癌组织和癌旁正常组织的表达量比较
实时荧光定量PCR检测结果显示，GRB2基因在肾癌组织和癌旁正常组织的相对表达量分别为3.18±0.55和0.98±0.31，两者比较差异具有显着性（t=6.98，P<0.001）。
3 讨 论
肾癌是起源于肾小管上皮的一种恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占成人恶性肿瘤的2%～3%[15]，其最常见的组织病理类型为肾透明细胞癌[16]，其次为乳头状肾细胞癌[17]。肾癌一直是肿瘤研究的热点之一。早期肾癌患者无明显的症状并缺乏经典可靠的分子诊断标志物，20%～30%的患者就诊时已经出现癌细胞的远处转移，即晚期肾癌[18]。早期发现和确诊是治疗肾癌的关键，特别是对肾癌患者的提前预测，一直是目前的研究重点。ATKINS等[19]指出肾癌标志物的鉴定和验证对于一线治疗的选择和优化至关重要，虽然目前已发现了包括PD-L1在内的多种肾癌标志物[20]，但仍有其临床局限性，如因为个体间的差异，单纯的指标升高并不能进行确诊，需要结合其他相关检查与临床症状进行全面综合考虑。因此，发现有价值的肾癌标志物对探讨肿瘤成因及评估患者预后至关重要。
本研究通过对ONCOMINE数据库的挖掘发现，GRB2基因在肾癌组织中显着高表达。通过对ONCOMINE数据库中的GRB2基因在正常肾组织和肾癌组织中的表达情况进行分析显示，肾癌组织中GRB2基因的表达水平明显高于正常肾组织。同时本研究又通过实时荧光定量PCR方法，对我院的6例肾癌患者的癌组织和癌旁正常组织标本进行了GRB2基因的检测，结果显示，GRB2基因在肾癌组织中的表达水平显着高于癌旁正常组织，与ONCOMINE数据库的分析结果一致，进一步提示了GRB2基因与肾癌发生发展的密切关系。
通过TCGA数据库收集GRB2基因表达水平与肾癌预后的相关数据，结果显示人GRB2基因高表达组患者与低表达组患者的生存率差异具有显着性。为进一步了解GRB2的生物学功能，我们利用STRING数据库构建了GRB2蛋白质-蛋白质互作网络图，与GRB2具有直接相互作用关系的蛋白有GAB2、CBL、EGFR、SHC1和SOS1。其中GAB2在卵巢肿瘤中出现高表达，并且GAB2在卵巢癌细胞中通过激活P13K途径来调节细胞迁移行为[21]。CBL是泛素连接酶CBL家族的重要成员之一，可使靶蛋白泛素化及降解从而调节靶蛋白功能。CBL可诱导受体及非受体酪氨酸激酶降解，参与细胞内信号通路的负调控，有抑癌作用[22]。EGFR是一种跨膜糖蛋白，是构成酪氨酸激酶受体ErbB家族的四个成员之一[23]。研究表明EGFR的生理功能是促进上皮组织的发育和调节体内稳态。在病理情况下，在多种实体肿瘤（肺癌、乳腺癌和成胶质细胞瘤）中存在EGFR基因突变以及EGFR蛋白水平的高表达或异常表达，因此可以推测，EGFR可能是肿瘤发生的驱动因素[24]。SHCl又称SHCA或SHC，属于SHC蛋白家族，该家族的蛋白在传递来自活化的酪氨酸激酶受体信号到下游信号分子中起着极其重要作用[25]。本研究再进一步对与GRB2蛋白具有相互作用关系的蛋白进行生物学功能分析后发现，GRB2具有对细胞增殖和凋亡的调节作用，参与了ERBB信号通路和EGFR信号通路，与目前的研究结果一致[26]。
综上所述，本研究通过对ONCOMINE数据库中肿瘤基因表达的深入挖掘，发现GRB2基因在肾癌中高表达，且其表达量与肾癌患者的预后密切相关。同时，GRB2基因可能是通过调控ERBB以及EGFR信号通路影响细胞增殖和凋亡促进肾癌的发生和发展。此将为进一步阐明GRB2基因在肾癌发生发展中的作用奠定理论基础，为肾癌的临床诊断和治疗以及寻找可能的药物靶标提供数据参考。
作者声明：何宁宁、解宸一、杨亚楠参与了实验设计；何宁宁、解宸一、王硕、赵万东、吕志远、宋静宜、杨亚楠参与了论文写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。
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（本文编辑 耿波 厉建强）
