李贝宁 姚征洋 焦倩 陈曦 姜宏 杜希恂
(青岛大学国家重点(培育)学科生理学,山东 青岛 266071)
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,其病理特征是黑质多巴胺能神经元的选择性丧失及残存的多巴胺能神经元中出现以聚集α-突触核蛋白(α-syn)为主要成分的路易小体。PD患者的临床症状主要表现为运动迟缓、静止性震颤和肌僵直［1-3］。其中5%～10%病例是单基因突变导致,另外环境因素也是导致PD发病的一个很重要的因素［4］,但是到目前为止,PD发病机制仍不明确。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)可通过诱导细胞内氧化应激、线粒体凋亡、炎症、兴奋性毒性和包涵体形成等一系列细胞内反应,造成小鼠黑质致密部多巴胺能神经元的缺失及纹状体多巴胺含量降低,进而出现PD样运动表型。MPTP诱导的PD模型是研究PD发病机制和药物干预的重要模型工具［5-7］。
近年来,通过生物信息学手段对生物大数据的分析在生物医学的多个领域均有应用。本研究利用R语言(Limma包)对公共基因芯片数据库(GEO)当中正常组和PD模型组小鼠黑质组织的基因表达谱芯片进行差异表达基因(DEGs)筛选［8］。并利用Metascape在线工具对DEGs进行GO功能富集分析以及KEGG通路分析,结合实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测结果,探讨PD模型小鼠黑质组织中相关基因组以及信号通路的变化,筛选出靶向DEGs,为临床预防、诊断以及治疗等方面研究提供新的思路和研究方向。
1 材料与方法
1.1 基因芯片来源
正常组和PD模型组小鼠黑质组织中基因表达谱芯片数据来源于NCBI的GEO数据库(http：/www.ncbi.nlm.gov/geo/),登录号为GSE4788。该数据库当中符合要求的小鼠黑质组织样本共8例,其中编号GSM108079、GSM108080、GSM108081、GSM108045为正常组小鼠的黑质组织样本,编号GSM108088、GSM108089、GSM108090、GSM108091为PD模型组小鼠黑质组织样本。
1.2 DEGs筛选
通过R语言(Limma包)筛选基因芯片中正常组和PD模型组小鼠黑质组织的DEGs,筛选条件为P<0.05,变化倍数>0.26。
1.3 火山图和热图分析两组小鼠黑质组织中的DEGs
将上面获得的每个DEGs表达水平的具体数值,按照R语言volcano及pheatmap包的要求做出对应的矩阵列表,采用火山图和热图对DEGs进行可视化分析。
1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析
采用Metascape在线工具将筛选出的上调和下调的DEGs进行分析,并进行GO功能富集分析和KEGG通路分析,以P<0.05为显着富集,P值越小表示富集越显着,通过R语言(ggplot2包)将分析结果可视化,获得P值较小的生物功能及具有显着差异的通路,同时选取参与这些功能和通路的基因,用于后续小鼠的验证。
1.5 RT-qPCR检测关键功能性基因的表达
8～10周龄雄性C57BL/6J小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司,分为正常组和试验组,每组4只。试验组的小鼠腹腔注射MPTP(20 mg/kg),正常组小鼠腹腔注射等剂量生理盐水,均每天1次,连续5 d。第5天时吸入异氟烷深度麻醉小鼠,眼部放血后断头取出小鼠脑组织,分离黑质组织后置于脱酶EP管中。每管中加入500 μL TRIzol,研磨仪研磨后,提取两组小鼠黑质组织的总RNA,并进行浓度与纯度的检测。
根据Vazyme逆转录试剂盒说明,以所提取的RNA为模板合成互补cDNA。采用SYBR-Green染料法定量检测目的基因Bdnf、Fbxw7、Sod1表达水平,根据荧光定量PCR说明书配制反应体系,每个样品设置3个复孔,采取两步法经过40个循环完成扩增,并采用2—ΔΔCT法计算各基因相对表达量。引物及其序列见表1。
表1 引物名称及其序列
2 结 果
2.1 正常组和PD模型组小鼠黑质组织的DEGs
R语言(Limma包)分析结果显示,正常组和PD模型组小鼠黑质组织中的DEGs共347个,其中有174个DEGs表达上调,173个DEGs表达下调(图1A、B)。图1A的横坐标为基因表达倍数的对数值,其中红色为上调的基因,蓝色为下调的基因,黑色为无显着差异基因;图1B中蓝色为低表达基因,红色为高表达基因。
A：DEGs的火山图分析,B：DEGs的热图分析
2.2 DEGs的GO功能富集分析以及KEGG通路分析
对正常组和PD模型组小鼠黑质组织中DEGs进行GO功能富集分析,结果显示,上调的DEGs显着参与了细胞大分子生物合成、分解代谢、神经元发育、铁离子稳态、蛋白水解及跨质膜输出等多个生物学功能,下调的DEGs显着参与了突触囊泡释放、跨突触复合体传递以及神经元凋亡等功能(图2A);KEGG通路分析显示,上调的DEGs参与朊病毒传播、Hippo信号等通路,下调的DEGs参与多巴胺能神经元突触形成、细胞骨架中肌动蛋白的调节等多个生物学功能(图2B)。R语言(ggplot2包)可视化分析显示,P值较小的生物功能及具有显着差异的通路为神经元凋亡、朊病毒传播,同时选取参与这些功能和通路的基因Bdnf、Fbxw7及sod1,用于后续小鼠的验证。
A：GO功能富集分析,B：KEGG通路分析
2.3 神经元凋亡相关基因Bdnf、Fbxw7及sod1的mRNA表达
正常组和PD模型组小鼠黑质组织中BdnfmRNA的相对表达量分别为1.40±1.13、0.32±0.36,Fbxw7 mRNA的相对表达量分别为1.16±0.66、0.37±0.37,sod1 mRNA的相对表达量分别为1.01±0.16、1.14±0.22。与正常组相比,PD模型组小鼠黑质组织中Bdnf、Fbxw7的表达量均显着降低(t=2.25、2.39,P<0.05),sod1的表达无显着差异(P>0.05)。
3 讨 论
PD是一种与年龄相关的神经退行性疾病,与众多基因和信号转导分子的表达异常有关。目前,几乎所有的治疗方式只能对症治疗,并不能从根本上逆转或延缓PD的发生或发展。近年来,关于PD的免疫和基因治疗研究也取得了一定的成效。然而,因为PD发病机制不明,这些治疗也只能针对少数普遍活化的通路或分子靶标,且临床疗效也不理想。因此,深入了解病程进展过程中的分子事件将成为人们寻求PD有效干预靶点的必要途径［9-11］。
基因芯片具有特异性好、通量高、时效快的特点,可直接检测mRNA的种类及丰度,进行整个基因组范围的基因表达分析,除具有高效、快速、平行化检测大规模基因表达的优势之外,还可以发现许多新的、潜在的、也许非常重要的PD相关基因,是研究基因表达的有力工具。本研究通过使用R语言(Limma包)和Metascape在线工具,对正常组和PD模型组小鼠黑质组织的基因芯片表达谱数据集进行了生物学挖掘以及生物信息学分析,以利于更进一步的PD分子生物学研究。
本研究首先从GEO数据库中下载8例来源于小鼠样本的基因表达谱,差异表达分析显示,PD模型小鼠黑质组织中上调的DEGs有174个,下调的DEGs有173个。为进一步了解这些DEGs在PD发病中的作用,又一步利用Metascape在线工具进行了GO功能富集分析和KEGG通路分析。GO功能富集分析结果显示,MPTP处理后,小鼠黑质组织表达上调的基因显着参与了细胞大分子生物合成、分解代谢、神经元发育、铁离子稳态、蛋白水解、跨质膜输出等生物学过程;而下调的基因显着参与了突触囊泡释放、跨突触复合体传递、神经元凋亡等过程。相关基因的上调预示着相关蛋白稳态失调及蛋白质组成完整性降低,可能会导致错误折叠和聚集的蛋白质进一步积累,增加了PD等神经退行性疾病的发病风险［12］。此外,PD中多巴胺能神经元的铁超载可能也与这些基因表达水平的改变有一定相关性［13-16］。铁超载通过生成大量羟自由基和引起细胞内α-syn的聚集,最终导致与运动和认知障碍相关的脑区神经元损伤。Netrin1是一种分泌型层粘连蛋白相关蛋白,对神经系统的发育至关重要。相关研究表明,Netrin1能够通过UNC5B受体调控Hippo通路在黑质多巴胺能神经元缺失中发挥关键作用［17-19］。KEGG通路分析表明上调的基因参与Hippo信号,因此这些基因的改变与PD的发生具有重要关系。在分析下调基因参与的生物学过程中,本研究发现最为显着的是参与细胞骨架组织的相关分子产生的调节,因此考虑到肌动蛋白在突触功能中的重要作用,提示在神经退行性疾病中存在这种细胞骨架成分的失调［20-22］。
通过GO功能富集分析和KEGG通路分析,P值较小的生物功能及具有显着差异的通路为神经元凋亡、朊病毒传播,选取参与这些功能和通路的关键功能性基因Bdnf、Fbxw7以及sod1又进行了RT-qPCR检测,结果显示,与正常组相比,PD模型组小鼠黑质组织中Bdnf、Fbxw7的表达量均显着降低,而sod1的表达量无显着差异。研究表明Bdnf基因编码的蛋白是神经生长因子家族的一员,在突触发育和可塑性过程中起着重要作用,其损伤与PD的病理症状相关,提示该神经肽减少促进了神经元的凋亡［23-24］;另外由于Fbxw7是一个重要的抑癌基因,且在蛋白酶体降解中发挥作用,从而影响细胞周期进展、细胞分化和存活,提示其缺失会影响细胞凋亡［25-26］。而PD中功能失调的Sod1蛋白的累积及神经元损伤可能与Sod1基因变化无关,提示野生型蛋白异常翻译后的修饰可能是由神经元内较强的氧化应激和退化脑区的金属离子稳态失调共同作用导致的［27］。另外,Sod1不同位点等位基因的携带者患PD的风险显着不同［28］。
本研究利用生物信息学技术及方法探讨了PD模型小鼠的DEGs,分析可能与PD疾病发生相关的DEGs及其相关的生物学过程,筛选得到的调控神经元凋亡的关键功能性基因Bdnf和Fbxw7在PD模型中有显着改变,为进一步阐明其在PD病理进展中的作用奠定了基础。该研究表明PD的发生、发展与多基因异常引起功能改变及多条信号通路异常有关,为临床PD的诊断及治疗提供了新的思路和理论依据。
伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学医学伦理委员会的审核批准(文件号QDU-AEC-2023350)。所有实验过程均遵照《青岛大学实验动物操作标准》的条例进行。
作者声明：李贝宁、杜希恂、姜宏参与了实验设计;李贝宁、姚征洋、焦倩、陈曦参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。
