余 健 聂国明 齐曼丽 邹敏书 李 琳 罗莉漫 徐洪涛 丁冬胜
Wnt信号通路因其启动蛋白Wnt而得名，其中Wnt/β－连环蛋白(catenin)信号通路为经典的信号转导途径:Wnt蛋白与其受体复合体结合，导致胞内蛋白β－catenin活化，并转位到核内，从而改变目的基因的表达，此信号通路在器官的发育、心血管疾病及肿瘤等起调控作用［1，2］。近年来，Wnt/β － catenin在肾脏疾病调控作用日渐受到重视，可诱导间质上皮转化(EMT)、肾纤维化的发生发展，成为抗肾纤维化治疗的靶点之一［3］。
骨形态发生蛋白(BMP－7)是转化生长因子－β(TGF－β)超家族成员之一，它在胚胎肾脏的发育以及成体肾脏功能的维持上具用重要作用。与TGF－β1诱导足细胞凋亡及促进肾纤维化作用相反，BMP－7是重要的足细胞存活因子及抗纤维化因子［4、5］。足细胞位于肾小球滤过屏障的最外层，主要防止血浆蛋白的滤出，BMP－7可通过激活Smad1/5/8信号通路并抑制TGF－β/Smad2/3信号通路从而减轻足细胞损伤［6］。BMP－7对 Wnt1/β －catenin信号通路的影响尚不清楚。为此，本研究探讨BMP－7对Wnt1/β－catenin信号通路的调节作用。
材料与方法
1．动物模型的制备:清洁级雄性Sprague－Dawley大鼠，约2月龄，体质量200±20g，购自武汉总医院动物实验中心［动物合格证号为SYXK(鄂)2008－0007］。采用1次性尾静脉注射嘌呤霉素氨基核苷酸100mg/kg诱导PAN模型［7］。大鼠首次给药后2周尿蛋白相对稳定时确认PAN模型制备成功。将20只PAN模型鼠随机分为两组:①PAN组(n=10);②BMP治疗组(BMP，n=10):自造模成功之日起，每周2次腹腔注射人重组BMP－7 30微克/(千克·次)［8］。正常组(NC，n=10)及PAN组给予等量的生理盐水注射，每周2次。各组共治疗10周。12周末实验结束时，异戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，取肾皮质甲醛固定、脱水、石蜡包埋备用。嘌呤霉素氨基核苷酸购自美国Sigma公司，人重组BMP－7购自美国Curis公司。
2．尿液指标测定:处死鼠前收集24h尿液标本，在1800r/min离心5min。随机选择20个高倍视野(×400)进行红细胞计数，结果用每个视野平均红细胞数表示;24h尿蛋白用双缩脲法测定。
3．血清指标测定:ELISA法测定血清 Cys C、MIF浓度。Cys C试剂盒购自上海德波生物技术公司。MIF试剂盒购自Gibco BRL公司。
4．RT－PCR检测肾小球Wnt1、β－catenin mRNA的表达:肾皮质剪成1mm3左右的碎片，加胶原酶A(1mg/ml)，放入水平摇床中，轻轻摇动，37℃消化30min，后转入100μm的筛网中，轻轻辗磨挤压分离肾小球，PBS洗3次，备用。依据生产商(美国Invitrogen公司)操作说明，应用TRIzol RNA系统提取总的RNA。应用反转录酶试剂盒按说明合成cDNA第一链，以cDNA第一链为模板在TaqDNA聚合酶作用下进行PCR扩增。利用Primers软件设计引物，引物序列如下:①Wnt1:正义5'－GAA CCT GCT TACAGA CTCCAA GAGT －3'，反义5'－CCG GAT TTT GGCTAT CAG A －3'，产物长度为98bp;②β－catenin引物:正义5'－GTCAGCTCGTGT CCT GTG AA－3'，反义:5'－ AGT GGCTGA CAG CAG CTT TT －3'，扩增产物片段为150bp;③GAPDH引物为:正义5'－ATT CGG ACG CCT GGT TAC－3'，反义5'－CTG TGC CGT TGA ACT TGC －3'，扩增片段为180bp;扩增条件为:预变性94℃ 3min，进入循环，变性95℃ 15s，退火 54℃ 80s，延伸72℃ 60s，32 个循环后72℃ 8min。将PCR产物在1．5%琼脂糖凝胶中进行电泳，置于凝胶图像分析系统(UVP公司，美国)行吸光度扫描，用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。
5．蛋白印迹测定肾小球Wnt1、β－catenin蛋白的表达:按上述方法分离肾小球，取100mg溶解于细胞裂解液中(25 mmol/L Tris － HCl，150mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF，1%Triton X －100，冰浴 1h，4℃ 12000r/min离心15min，抽提细胞总蛋白，Lowry法测定蛋白浓度。取细胞裂解蛋白50μg经Tricine SDS凝胶电泳后转移至PVDF膜;5%脱奶粉封闭PVDF膜2h，加入羊抗Wnt1、兔抗catenin多克隆一抗。4℃过夜，洗膜后加辣根过氧化物标记的二抗(1∶500稀释)，37℃孵育2h;洗膜后加ECL试剂，显色后，用凝胶成像及分析系统对条带进行定量分析。Wnt1、β－catenin蛋白相对含量用GAPDH作为内参。
6．统计学方法:采用SPSS11．0软件进行数据处理，所有数据用表示，方差齐时，多组比较用One－way ANOVA LSD方差分析;方差不齐，多组比较用Kruskal－Wallis方法，两组间比较用Mann－Whitney方法，p＜0．05为差异有统计学意义。
结 果
1．尿液及血清指标检测:PAN组尿液红细胞(UE)及24h尿蛋白(24h UP)的排泄较NC组显着升高(p＜0．01);血清 Cys C 较 NC 组亦显着升高(P ＜0．01)，MIC升高(p＜0．05)，差异有统计学意义。BMP－6组UE及24h UP的排泄较PAN组显着降低(p＜0．01)，血清中Cys C、MIC 降低 (P ＜0．05)，见表1。
表1 3组大鼠尿液及血清指标的比较
表1 3组大鼠尿液及血清指标的比较
与 NC 组相比，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．05;与 PAN 组相比，★P ＜0．01，★★P ＜0．05
组别 n UE(个/HP) 24h UP(mg) Cys C(mg/L) MIC(μg/L)10 1．97 ±1．15 0．55 ±0．18 0．60 ±0．12 5．26 ±1．33 PAN 组 10 13．90 ±4．65* 7．21 ±1．07* 1．21 ±0．36* 6．87 ±1．38＊＊BMP －6 组 10 7．68 ±4．35＊★ 5．24 ±1．06＊★ 0．90 ±0．15＊★★ 5．63 ±1．26 NC组★★
2．肾小球Wnt1、β－catenin mRNA的表达:PAN组Wnt1、β－catenin mRNA的表达较NC组分别增加121%、164%(P ＜0．01);而 BMP－6组较 NC 组分别增加57．9%、50．0%(P ＜0．05 或P ＜0．01)。与PAN组比较，BMP－6组 Wnt1、β－catenin mRNA的表达分别减少28．5%、43．2%(P ＜0．01)，见图 1、表2。
图1 3组大鼠肾小球Wnt1、β－catenin mRNA的表达
表2 3组大鼠肾小球Wnt1、β－catenin mRNA表达相对值的比较
与 NC 组相比，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．05;与PAN 组相比，★P ＜0．01
10 0．19 ±0．06 0．14 ±0．07 PAN 组 10 0．42 ±0．09* 0．37 ±0．09*BMP －6组 10 0．30±0．06＊★ 0．21±0．06－catenin NC组组别 n Wnt1 β＊＊★
3．肾小球Wnt1、β－catenin蛋白的表达:Wnt1和β－catenin蛋白表达与两者mRNA的表达类似。NC组Wnt1、β－catenin两者仅微量表达。PAN组Wnt1、β－catenin蛋白表达较 NC组分别增加147%、57.6%(p＜0．01);而BMP－6组较NC组分别增加73．3%(P ＜0．01)、18．2%(P ＞0．05)。与 PAN 组比较，BMP－6组Wnt1、β－catenin mRNA的表达分别减少 29．8%、25．0%(P ＜0．05 或 P ＜0．01)，见图 2、表3。
表3 3组大鼠肾小球Wnt1、β－catenin蛋白表达相对值的比较
与 NC 组相比，*P ＜0．01;与 PAN 组相比，★P ＜0．01，★★P ＜0．05
10 0．15 ±0．05 0．33 ±0．05 PAN 组 10 0．37 ±0．09* 0．52 ±0．07*BMP －6组 10 0．26±0．08＊★★ 0．39 ±0．06－catenin NC组组别 n Wnt1 β★
讨 论
Wnts是一种分泌型糖蛋白家族，包括19种Wnt蛋白，目前仅了解其中的少部分如Wnt1、Wnt4等。β－catenin是一种细胞骨架蛋白，与E－钙黏蛋白(E－cadherin)、α－连环蛋白(α－catenin)等共同参与细胞连接的构建和细胞间的黏附机制［9］。正常状态下β－catenin主要表达于上皮细胞胞膜，极少表达于胞质。同时β－catenin也是Wnt/β－catenin途径的核心分子，β－catenin的异位表达即在胞质内聚集并进入胞核是Wnt途经发挥生物学作用的关键步骤:Wnts与细胞膜受体Frizzled及共同受体LRP5/6结合，激活胞质内的蛋白，使β－catenin的降解复合物β－catenin去磷酸化而降解减少，并转移至细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子结合，促进EMT的发生和肾间质的纤维化［10］。啮鼠动物模型中，BMP－7对慢性肾疾病(CKD)有保护作用，外源性给予BMP－7减轻肾纤维化和足细胞的凋亡，使用rh BMP－7有望成为治疗CKD的有效药物之一［11］。
血清Cys C较血肌酐更早、更准确反映肾损伤［12］。MIF是一种炎症细胞因子，在CKD病人血清中升高，并与氧化应激的标志物密切相关［13］。本研究结果表明，PAN 组 UE、24h UP、Cys C、MIC水平较正常组均显着升高，使用BMP－6组上述指标明显改善。可见BMP－7可减轻血尿、蛋白尿，对肾损伤及炎症反应有保护作用。PAN大鼠模型以足细胞足突融合及大量蛋白尿为特点，主要病变在足细胞［14］。肾小球足细胞是BMP－7作用的主要靶点。我们研究显示，BMP－7可减少PAN鼠肾小球Wnt1和βcatenin mRNA和蛋白质的表达，为其治疗足细胞疾病提供了一定的依据。
TGF－β1是足细胞损伤因子，可诱导足细胞发生EMT，并抑制nephrin的表达;而BMP－7是足细胞保护因子，可拮抗 TGF － β1诱导 EMT 的发生［15，16］。外源性BMP－7可有效抑制糖尿病鼠引起的nephrin表达下降，维持其在足细胞上的正常分布［8］。Dai等［17］研究表明，在体内Wnt信号通路在足细胞功能异常和白蛋白尿中起中心作用:足细胞损伤激活Wnt/βcatenin信号通路，抑制nephrin的表达，导致白蛋白尿;去除足细胞β－catenin大鼠可以防止足细胞功能失常和白蛋白尿。可见，BMP－7的肾保护作用与拮抗 TGF－β1，抑制β－catenin通路，上调nephrin的表达有关。
总之，Wnt1/β－catenin信号可能是治疗以蛋白尿为主的肾疾病的新靶点，而BMP－7可拮抗Wnt1/β－catenin信号通路对肾损伤的保护作用。
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