金艳坤 井晓婷 罗 靖 余 红 张 雯 张湘燕 叶贤伟
支气管肺癌是严重危害人类健康的疾病，有资料显示，肺癌无论是年发病人数还是年死亡人数，均位居全球癌症首位［1］。肺癌是一种与环境因素、生活方式及遗传因素有关的恶性疾病，其发生、发展与炎性介质和某些与癌发病相关的基因多态性有关，并存在一定的遗传易感性差异和家族聚集性［2，3］。单核细胞趋化蛋白-1( monocyte chemoattractant protein -1，MCP-1) 是CC 类趋化因子，是一种重要的炎性细胞因子，参与机体多种炎性反应过程，研究表明MCP-1 -2518 基因多态性可能与恶性肿瘤的易感性相关［4，5］。目前MCP-1 基因多态性与肺癌关系的相关研究少见。笔者采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态( PCR-RFLP) 技术进行基因多态性的检测，以期发现MCP-1 -2518 基因多态性与肺癌遗传易感性的相关性。
材料与方法
1.研究对象：选取2013 年3 ～12 月在贵州省人民医院呼吸与危重症医学科住院治疗的肺癌患者90 例作为实验组，其中男性58 例，女性32 例，患者年龄40 ～79 岁，平均年龄57.5±11.3 岁。32 例同期健康体检者作为对照组，其中男性19例，女性13 例，年龄42 ～76 岁，平均年龄55.7 ±13.1 岁。实验前所有受试者均签署知情同意书。两组受试者均排除严重心血管疾病、肝肾功能不全、自身免疫性疾病、急性或严重慢性感染性疾病等，且相互间无血缘关系。经检验，两组间年龄、性别差异无统计学意义，具有可比性。
2.实验方法：(1) 实验标本收集 所有研究对象均于清晨空腹抽取外周静脉血2ml( EDTA 抗凝) ，摇匀后置于-80℃冰箱保存，用于基因组DNA 的提取。( 2) MCP -1 基因多态性检测：1) 全血基因组DNA 的提取： 使用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，提取的DNA 进行紫外分光光度检测。2) 引物合成及PCR 扩增：根据参考文献［6］，合成引物。上游引物：5' -TTCTCTTCTACGGGATCTGGG -3'，下游引物： 5' - GTCTCTCCTGGCTTTAGTCAT-3'。进行PCR 扩增： 第1 阶段94℃3min； 第2 阶段：94℃30s，55℃30s，72℃1min，循环30 次；第3 阶段：72℃5min。3) PCR 产物的检测、限制性酶切：PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用紫外线凝胶成像系统判定目的条带。扩增产物用PvuⅡ限制性内切酶进行酶切。酶切产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，使用紫外线凝胶成像系统观察酶切结果并成像。
3.统计学方法：对实验对象进行Hardy -Weinberg 遗传平衡检验，以了解所收集的标本是否具有良好的群体代表性( P＞0.05) 。使用SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行统计学处理。采用χ2检验对不同两组间基因型或等位基因分布频率的差异进行比较，P ＜0.05 为差异有统计学意义。对频率差异有统计学意义的基因型或等位基因进行比值比( odds ratio，OR) 及其95%可信区间( confidence interval，CI) 的计算，OR 表示相对风险度。
结 果
1. MCP -1 -2518A/G 基因多态性结果分析：(1) MCP-1 -2518A/G 位点PCR 扩增后琼脂糖凝胶电泳结果： 扩增目的DNA 片段为466bp。PCR 产物在2%琼脂糖凝胶电泳证实，在400 ～500bp 之间有一条清晰的电泳带，说明目的DNA 的PCR 扩增成功( 图1) 。(2) MCP-1 -2518A/G 位点PCR 产物PvuⅡ酶切后琼脂糖凝胶电泳结果： DNA 片段经限制性内切酶PvuⅡ酶切后，在2%琼脂糖凝胶上电泳观察3 种基因型：AA 基因型仅见1 条466bp 的电泳带，GG基因型有327bp 和139bp 两条电泳带，AG 基因型有466bp、327bp 和139bp 3 条电泳带( 图2) 。
图1 MCP-1 -2518G/A PCR 扩增产物电泳图
图2 MCP-1 -2518G/A PCR 产物PvuⅡ酶切后电泳图
2.MCP-1 -2518A/G 多态性基因型分布在实验组与对照组的比较： 经验证，基因型在实验组和对照组的分布频率符合Hardy -Weinberg 遗传平衡，具有群体代表性。对照组中AA、AG、GG 基因型的分布频率分别为：6.2%、46.9%、46.9%； 实验组中分别为：26.7%、46.6%、26.7%；3 种基因型在两组间分布频率差异具有统计学意义( P =0.022，表1) 。经χ2检验及风险性分析得出，AA 基因型个体患肺癌的相对风险度高，GG 基因型个体患肺癌的相对风险度较低，携带A 等位基因的个体患肺癌的相对风险是携带G 等位基因个体的2.368 倍，A 等位基因在病例组和对照组的分布频率差异具有统计学意义( 表2) 。
表1 实验组和对照组MCP-1 -2518A/G 基因型频率Hardy-Weinberg 平衡及组间比较［n( %) ］
表2 基因型和等位基因分布频率在两组中的比较［n( %) ］
讨 论
单核细胞趋化蛋白-1( monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1) 是CC 类趋化因子，位于17 号染色体上，包含3 个外显子和两个内含子，是一种重要的炎性细胞因子，参与机体多种炎性反应过程。目前研究显示MCP-1 可通过向肺癌组织内趋化单核-吞噬细胞、促进肿瘤血管生成、肿瘤免疫逃逸等途径影响肺癌的发生、发展［7］。Rovin 等［8］研究发现在MCP-1 元的调控区-2518A/G 位点，存在A -G 碱基突变，即AA、AG、GG 3 种基因型。MCP - 1 -2518A/G 位点突变可能影响MCP -1 的表达而影响肿瘤免疫效应，最终影响肿瘤的发病。多个研究表明MCP-1 基因-2518 位点A/G 多态性在一定程度上可以影响到肿瘤的遗传易感性，并在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用［4，5］。尽管MCP-1 及其多态性与肿瘤关系密切，但由于肿瘤的类型及地域、种族、环境及饮食等方面的差异均可能导致研究结果的不同，且目前MCP-1 基因多态性与肺癌关系的相关研究少见。
目前认为肺癌的发生与炎性反应关系密切。炎症部位的细胞、分子或基因的改变对肺癌的发生、进展起着重要作用。慢性或持续性炎症可诱导炎性细胞大量聚集，产生多种炎性细胞和趋化因子并引起级联反应，诱导正常细胞DNA 氧化损害，激活癌基因，导致肿瘤发生。近年来研究证实肿瘤微环境的产生对肿瘤发生有关键作用。炎性反应引起肿瘤微环境募集大量巨噬细胞，中性粒细胞清除延迟、活性氧物质增加，引起肿瘤发生，微环境中的生长因子和血管生成因子使肿瘤部位的血管生成，促进肿瘤细胞增殖和转移。肺内微环境改变可激活肺癌发生的相关信号通路、导致慢性炎症发生。慢性持续性感染可以引起支气管-肺泡干细胞增殖，致肺上皮细胞癌变，还能使基因组不稳定，引起DNA 损伤、癌基因激活或抑癌基因失活［9，10］。
基因多态性可导致人类患各种疾病的易感性不同，人类MCP-1 -2518A/G 基因多态性存在种族差异性。曾有报道，墨西哥人和亚洲人群携带G 等位基因者较高加索人和非洲人群多［11］。中国台湾地区人群MCP-1 -2518 的G 等位基因频率为52.4%，与已证实的亚洲人群(47%) 和墨西哥人群(47%) 相似，而高加索人群的G 等位基因频率为29%，而非裔美国人的G 等位基因更低，只有22%［12］。土耳其人A 和G 等位基因的频率分别为71%和29%、高加索人 为 73% 和 27%、韩 国 人 分 别 为 39.8% 和60.2%［13～15］。
本研究将90 例肺癌患者和32 例健康对照的MCP-1 -2518A/G 基因位点基因型进行检测，结果显示在贵州地区汉族人群中存在MCP-1 -2518A/G基因多态性，健康人群的AA、GG、AG 基因型的分布频率与上述亚洲人群基因分布频率相似［10，12］；MCP-1 -2518A/G 3 种基因型在实验组和对照组中频率分布差异具有统计学意义：在实验组中AA 基因型的频率明显较对照组高，GG 基因型频率明显较低，AA 基因型个体患肺癌的相对风险度高，GG 基因型个体患肺癌的相对风险度较低；A 等位基因在实验组和对照组的分布频率差异有统计学意义( P ＜0.05) ，即携带A 等位基因的个体患肺癌的相对风险是携带G 等位基因个体的2.368 倍，提示MCP -1 -2518A/G 中A 等位基因可能是贵州地区汉族人群患肺癌的遗传易感基因。
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