维生素D在卵巢癌中的作用

李赛赛 盛 波 朱雪琼

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，由于缺乏有效的早期诊断方法，大多数女性确诊时已为晚期，失去了手术时机，其5年生存率只有20%～30%，严重威胁妇女的健康[1]。维生素D(vitamin D)是人体必需的一种维生素，1,25二羟维生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25(OH)2D3]是体内维生素D的主要活性形式，而25-羟基维生素D(25-hydroxyvitamin D, 25OHD)为1,25(OH)2D3的前体，是目前评估人体内维生素D水平最可靠的指标[2]。研究表明，维生素D在人体内发挥了重要作用，不仅参与调节体内钙磷代谢，同时与多种肿瘤的发生有着密切的联系[3]。近年来，维生素D在卵巢癌中的作用引起了越来越多研究者的重视，并取得了一些研究成果。因此，本文就维生素D与卵巢癌的发病风险、在卵巢癌癌变中的表达变化、对卵巢癌细胞生物学行为的影响以及卵巢癌预后的影响等方面的研究进展做一综述。

一、维生素D与卵巢癌的发病风险

近年来有关维生素D与卵巢癌的研究备受关注，然而关于体内维生素D水平与卵巢癌之间的潜在关系目前仍存在争议。Arslan等[4]为研究血清25OHD水平与随后发生侵袭性上皮性卵巢癌的风险之间的关系，采用巢式病例对照研究方法，选取队列中170例侵袭性上皮性卵巢癌作为病例组，并从队列中随机抽取配对的373例健康人作为对照组，采用放射免疫检测两组诊断前的血清25OHD水平，从血清样本收集到肿瘤诊断平均随访了5.5年，使用配对Logistic回归模型分析，控制潜在的混杂因素，研究发现，即使排除了采血5年内确诊为卵巢癌的女性，并进行一系列的亚组分析如维生素D受体的遗传变异、临床分期、病理分级、组织学类型、体重指数(body mass index, BMI)、绝经情况等来控制可能的混杂因素后，血清25OHD水平与卵巢癌的发病风险没有相关性。

Tworoger等[5]应用配比的巢式病例对照研究,研究维生素D水平[血浆25OHD及1,25(OH)2D3水平]与卵巢癌发病风险之间的关系。该研究综合分析了3项前瞻性队列研究中的827例女性(224例病例和603例对照)，使用放射免疫检测其维生素D水平，从血清样本收集到肿瘤诊断平均随访了5.5年，使用配对Logistic回归模型来估计相对危险度(relative risks, RR)和95%置信区间(95% confidence interval, 95% CI)，结果发现血浆25OHD及1,25(OH)2D3水平与卵巢癌的发病风险均没有相关性；而在体重指数>25kg/m2的妇女中，血浆25OHD水平与卵巢癌的发病风险之间存在着显着的负相关，且具有充足的25OHD水平(≥32ng/ml)的妇女与25OHD水平不足的妇女比较，其患浆液性卵巢癌的风险略有下降，RR分别为0.39(95%CI:0.16～0.93)和0.64(95% CI:0.39～1.05)。随后，一项巢式病例对照研究分析了来自7个队列研究中的516例卵巢癌病例和770例对照，采用化学发光免疫法检测25OHD水平，从血清样本收集到肿瘤诊断平均随访了5.9年，并进行Logistic回归模型分析，结果发现血清25OHD浓度与卵巢癌的发病风险无关。研究者为了进一步评估联系中潜在的异质性，对多种因素进行了分层分析，按照肿瘤亚型、抽血年龄、抽血季节、种族及口服避孕药进行分层分析，结果仍提示，血清25OHD浓度与卵巢癌发病风险无相关性。然而，按体质指数进行的分层分析结果却表明，在超重和肥胖(BMI≥25kg/m2)妇女中，体内维生素D水平与卵巢癌发病风险呈负相关[6]。恶性肿瘤风险算法(risk of malignancy algorithm, ROMA)评分可通过结合肿瘤标志物人类附睾蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)和糖链抗原-125(carbohydrate antigen 125, CA125)来预测发生上皮性卵巢癌的风险。Anastasi等[7]的研究纳入了180例肥胖妇女(BMI>30kg/m2)，80例正常体重的妇女(BMI<25kg/m2)，使用全自动免疫分析仪检测血清25OHD水平，并以20.2ng/ml作为划分界限值，将其分为25OHD水平充足和25OHD水平不足。研究结果表明，64%的肥胖妇女及11%正常体重的妇女存在血清25OHD水平不足，差异有统计学意义。该学者进一步发现ROMA评分高于13%仅在肥胖女性中检测到，其中64%的肥胖女性在ROMA评分高于13%的同时伴有血清25OHD水平的不足，只有36%的肥胖女性在ROMA评分高于13%的同时有充足的25OHD水平，差异有统计学意义，提示肥胖妇女中低维生素D水平与高ROMA评分有关。以上研究结果表明，虽然维生素D水平与卵巢癌的总体发病风险没有相关性，但在超重和肥胖妇女中，低维生素D水平与卵巢癌的发病风险呈正相关。

Toriola等[8]选取芬兰孕妇队列为研究对象进行配比的巢式病例对照研究,从血清样本收集到肿瘤诊断总共随访了10年，根据随后是否发展为卵巢癌，分为病例组(201例)和对照组(398例相同季节对照和199例相反季节对照)，采用放射免疫检测血清25OHD水平，条件Logistic回归分析表明，血清25OHD浓度与卵巢癌发病风险之间没有明显的相关性；然而，研究者发现与血清25OHD充足的妇女(≥75nmol/L)相比，血清25OHD不足(<75nmol/L)的妇女患卵巢癌的风险增加了3倍，但差异无统计学意义。在2016年，Ong等[9]进行了一项大型孟德尔随机化研究，其中纳入了 31719例欧洲女性(10065例卵巢癌病例及21654例对照)，选取单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点rs7944926(DHCR7)，rs12794714(CYP2R1)及rs2282679(GC)作为血清25OHD水平的工具变量进行分析，研究25OHD浓度与卵巢癌之间的关联性。逆方差加权法结果表明，当25OHD浓度每降低20nmol/L时，用SNP联合估计所有上皮性卵巢癌亚型(10065例)的发病风险的优势比为1.27(95%CI：1.06～1.51)，在高级别浆液性卵巢癌(4121例)中的优势比为1.54(95%CI：1.19～2.01)，提示低25OHD水平与较高卵巢癌发生率相关，且在高级别浆液性卵巢癌的关联性最明显。

二、维生素D在卵巢癌癌变中的表达变化

近年来的研究表明，卵巢癌患者的血清25OHD水平显着低于健康女性及卵巢良性肿瘤患者。Bakhru等[10]选取来自国家健康与营养调查研究的7273例研究对象进行了病例对照研究，采用自动化免疫学方法测定血清25OHD水平。Logistic回归分析结果表明，卵巢癌患者处于低25OHD水平的概率是对照组的3.68倍。在多变量模型中，当调整了年龄、体重指数和饮食等潜在的混杂因素之后，血清25OHD水平与卵巢癌的这种关系依然存在。研究者进一步对包括年龄和膳食钙摄入在内的显着协变量进行调整后，发现卵巢癌患者低25OHD水平的可能性是对照组的3.92倍。Walentowicz-Sadlecka等[11]的研究纳入了72例卵巢癌患者及65例健康女性，所有卵巢癌患者均行理想的肿瘤细胞减灭术(最大残余癌灶直径<1cm)，且均接受6个疗程的卡铂联合紫杉醇化疗。研究者用电化学发光免疫法测定健康女性及卵巢癌患者术前的血清25OHD浓度，结果发现卵巢癌患者的血清25OHD水平显着低于健康对照组，且其出现低维生素D的可能性是对照组的3.71倍。研究者进一步对卵巢癌患者进行亚组分析，结果发现血清25OHD浓度与卵巢癌组织学亚型、病理分级、临床分期及绝经情况均无明显相关性。随后，Granato等[12]的研究纳入了61例健康妇女、45例卵巢良性肿瘤妇女及46例近期诊断为卵巢癌的妇女，结果表明，26%健康妇女、24%卵巢良性肿瘤妇女及80%卵巢癌妇女均处于低血清25OHD水平(<20ng/ml)，且卵巢癌患者的血清25OHD水平与健康女性或卵巢良性肿瘤患者比较，差异均有统计学意义。崔伟等[13]纳入58例卵巢癌患者，30例卵巢良性疾病患者为卵巢良性疾病组及30例健康女性为对照组，采用化学发光法检测血清25OHD水平，研究结果表明，卵巢癌患者的血清25OHD水平较卵巢良性疾病组和对照组显着下降，且血清25OHD浓度在晚期患者(FIGO Ⅲ期和Ⅳ期)中显着低于早期患者(FIGO Ⅰ期和Ⅱ期)，提示血清25OHD与卵巢癌临床分期相关，并随着肿瘤进展其浓度呈下降趋势。进一步根据病理类型分析却发现，卵巢癌患者的血清25OHD浓度与临床病理类型(浆液性、黏液性、子宫内膜样、透明细胞性)无关。

三、维生素D对卵巢癌细胞生物学行为的影响

1.对卵巢癌细胞增殖的影响:研究表明，维生素D与卵巢癌细胞的增殖密切相关。Thill等[14]分别用不同浓度(0.001、0.01、0.1、1、10及50μmol/L)活性维生素D(骨化三醇)处理人卵巢癌细胞株SKOV3及OVCAR3，用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法检测细胞的增殖情况，结果发现不同浓度(0.01、0.1、1、10及50μmol/L)骨化三醇均能显着降低SKOV3及OVCAR3细胞的增殖活性，且与0.1%DMSO溶剂对照组比较，10μmol/L骨化三醇组的OVCAR-3细胞增殖率被抑制到了28%，SKOV-3细胞增殖率被抑制到了45%。Zhang等[15]用不同浓度(0.1、1、5、10、50、100、200及500nmol/L)的1,25(OH)2D3及(0.2、2、20、40、80及160mg/L)卡铂处理人卵巢癌SKOV-3细胞，用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞增殖情况，结果显示1,25(OH)2D3及卡铂均呈剂量依赖性地抑制卵巢癌细胞增殖。与单用卡铂组比较，1,25(OH)2D3联合卡铂组的抑制率显着增加，可见两药联合使用具有协同抑瘤作用。Jung等[16]采用CCK-8法检测3种人卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR3、OVCA433)的增殖情况，结果显示，50μmol/L骨化三醇与71nmol/L苗勒管抑制因子均可抑制卵巢癌细胞系(SKOV3、OVCAR3、OVCA433)的增殖，且两者联合应用时的抑制作用更加明显。Abdelbaset-Ismail等[17]用不同浓度(10-10、10-9、10-8及10-7mol/L)1,25(OH)2D3处理人卵巢癌细胞株A2780，并使用流式细胞荧光分选技术计数细胞，结果显示，与空白对照组比较，1,25(OH)2D3能明显抑制卵巢癌细胞增殖，并呈剂量依赖性。薛昕等[18]采用不同浓度(10-9、10-8及10-7mol/L)的1,25(OH)2D3处理人卵巢癌细胞株HO8910，通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]测定细胞的生长抑制率，发现与无水乙醇对照组比较，3个浓度的1,25(OH)2D3均对卵巢癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，并呈时间和剂量依赖性。目前认为1,25(OH)2D3主要是通过与维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)结合而发挥生物活性作用，且细胞周期调节机制的紊乱在肿瘤的发生、发展过程中发挥了重要作用。因此，研究者进一步采用流式细胞技术进行细胞周期分析，并通过反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测VDR mRNA的表达水平，发现1,25(OH)2D3处理组的G0/G1期细胞比例较无水乙醇对照组增高，且1,25(OH)2D3使HO8910细胞的VDR mRNA的表达水平上调，提示1,25(OH)2D3通过上调VDR mRNA的表达水平来诱导卵巢癌细胞周期改变，使细胞停滞于G0/G1期，从而抑制卵巢癌细胞增殖。研究表明，p27基因作为细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors，CDKIs)的家族成员之一，可抑制细胞进入S期，其表达水平的变化与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。而S期激酶相关蛋白(S-phase kinase-associated protein2，Skp2)主要负责介导包括p27在内的细胞周期调控蛋白的泛素化，使细胞能从G1期进入S期，从而进行细胞增殖。李平平等[19]为研究1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞增殖的影响及经1,25(OH)2D3作用后Skp2和p27蛋白表达变化，选取人卵巢癌细胞株HO8910作为研究对象进行体外实验，用MTT法检测细胞的增殖情况，发现1,25(OH)2D3呈浓度时间依赖性地抑制卵巢癌细胞增殖。流式细胞技术显示，1,25(OH)2D3能增加G0/G1期细胞比例，减少处于S、G2/M期的细胞比例，从而降低卵巢癌细胞增殖指数。免疫细胞化学染色检测发现1,25(OH)2D3组Skp2表达减少，而p27蛋白表达增加，提示1,25(OH)2D3可能通过减少Skp2表达，使p27蛋白表达增多，引起细胞周期改变，使癌细胞停止在G0/G1期，从而阻断卵巢癌细胞的增殖过程。随后，王君等[20]报道1,25(OH)2D3能呈时间及剂量效应依赖性地抑制卵巢癌HO8910细胞的增殖，且p27蛋白的表达水平随着1,25(OH)2D3作用时间和作用剂量的增加也相应升高结果基本一致。另一方面，细胞生长调控基因GADD45是维生素D重要的靶基因。在卵巢癌细胞中，1,25(OH)2D3主要通过VDR与位于GADD45 1个外显子的维生素D反应元件(vitamin D response element, VDRE)结合，促进GADD45基因转录，上调其蛋白表达水平，从而介导细胞阻滞于G2/M期[21]。程虹等[22]用10-7mol/L 1,25(OH)2D3处理人卵巢癌细胞系OVCAR3，MTT分析结果表明，与乙醇对照组比较，1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞生长有明显的抑制作用。流式细胞仪分析细胞周期结果显示，1,25(OH)2D3使处于G0/G1期和G2/M期的细胞比例增多，而S期细胞比例明显减少。免疫印迹分析Western blot法检测结果显示，1,25(OH)2D3使OVCAR3细胞的p27和GADD45蛋白表达增多，提示1,25(OH)2D3通过调节p27和GADD45蛋白表达水平来调控细胞周期，从而抑制卵巢癌细胞的增殖。

2.对卵巢癌细胞凋亡的影响：Zhang等[15]选取人卵巢癌SKOV3细胞系作为研究对象，将其分为4组：空白对照组、10nmol/L 1,25(OH)2D3组、40mg/L卡铂组及10nmol/L 1,25(OH)2D3联合40mg/L卡铂组，用流式细胞技术检测细胞的凋亡情况，结果发现，与空白对照组相比，1,25(OH)2D3组细胞凋亡数增加不明显，而卡铂组细胞凋亡数明显增加，且1,25(OH)2D3联合卡铂组的细胞凋亡显着增多。此外，研究者用共聚焦激光扫描显微镜下的DAPI染色观察到了1,25(OH)2D3联合卡铂组细胞的DNA断裂、染色质浓缩和凋亡小体的形成，且与单用1,25(OH)2D3或卡铂组的细胞比较，1,25(OH)2D3联合卡铂组细胞的凋亡细胞核DNA片段相对较多，提示1,25(OH)2D3能明显增强卡铂诱导的细胞凋亡。马淑状等[23]为研究1,25(OH)2D3单独及其与顺铂合用对卵巢癌细胞凋亡的影响，选取人卵巢癌细胞株HO8910为研究对象进行体外实验。流式细胞术测定细胞凋亡率结果显示，与细胞对照组比较，10-7mol/L 1,25(OH)2D3组和4μg/ml顺铂组均能诱导HO8910细胞凋亡；且两者合用时细胞凋亡率较单用1,25(OH)2D3或顺铂组明显上升。研究者进一步采用免疫细胞化学法观察促凋亡蛋白Bax的表达变化，发现与细胞对照组比较，单用1,25(OH)2D3组和顺铂组细胞的Bax蛋白表达水平上升，两药合用组细胞的Bax蛋白表达较单用1,25(OH)2D3或顺铂组明显增强，提示1,25(OH)2D3与顺铂合用能协同诱导卵巢癌HO8910细胞凋亡。Jung等[16]通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测量卵巢癌细胞株(SKOV3、OVCAR3、OVCA433)的细胞DNA片段化水平来评估细胞凋亡情况，结果显示与空白对照组比较，50μmol/L骨化三醇组DNA片段化水平在3组细胞中均明显上升；且50μmol/L骨化三醇联合71nmol/L苗勒管抑制因子组的细胞DNA片段化水平与单用71nmol/L苗勒管抑制因子组相比显着增加，提示维生素D能增强苗勒管抑制因子诱导卵巢癌细胞的凋亡。该课题组进一步用免疫印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、BAX、caspase-3、caspase-9)的表达，结果发现与单用苗勒管抑制因子组比较，骨化三醇联合苗勒管抑制因子组的促凋亡蛋白BAX、caspase-3和caspase-9水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降，提示维生素D通过激活促凋亡蛋白或抑制抗凋亡蛋白的表达来促进细胞凋亡。Abdelbaset-Ismail等[17]用不同浓度(10-10、10-9及10-8mol/L)的1,25(OH)2D3处理人卵巢癌细胞株A2780,使用流式细胞术分析发现与空白对照组比较，1,25(OH)2D3组的凋亡细胞数量明显增加。Jiang等[24]选取OVCAR3细胞系为研究对象，用流式细胞技术检测细胞凋亡情况，结果显示与乙醇对照组比较，用10-7mol/L 1,25(OH)2D3处理组凋亡细胞的比例明显增加，且1,25(OH)2D3可使细胞凋亡指数高达3.5倍。该学者进一步研究发现维生素D是通过降低体内人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT) mRNA的稳定性，进而降低了端粒酶的活性，诱导卵巢癌细胞凋亡。高四海等[25]采用不同浓度(10-9、10-8及10-7mol/L)1,25(OH)2D3处理SKOV3细胞，采用TUNEL细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡，结果显示与乙醇对照组比较，1,25(OH)2D3处理组的SKOV3细胞核内DNA断裂点增加，细胞凋亡率升高，且存在显着的剂量效应关系，提示1,25(OH)2D3可通过引起SKOV3细胞DNA断裂从而诱导卵巢癌细胞凋亡。

3.对卵巢癌细胞侵袭及迁移的影响：Abdelbaset-Ismail等[17]的研究中，采用不同浓度(10-10、10-9、10-8及10-7mol/L)的1,25(OH)2D3处理人卵巢癌细胞株A2780，使用Transwell迁移实验检测各组细胞的迁移情况，结果显示与空白对照组比较，1,25(OH)2D3处理组呈剂量依赖性地抑制卵巢癌细胞的迁移。Hou等[26]选取人卵巢上皮腺癌细胞系SKOV3为研究对象，用不同浓度(1、10及100nmol/L)的1,25(OH)2D3处理细胞，通过划痕实验评估其迁移能力，结果显示1,25(OH)2D3能明显抑制卵巢癌细胞迁移，并呈时间和剂量依赖性。进一步利用Matrigel基质胶进行体外细胞侵袭能力研究，发现1,25(OH)2D3能明显抑制卵巢癌细胞侵袭。Lungchukiet等[27]分别用乙醇对照及10-7、10-8mol/L 1,25(OH)2D3处理卵巢癌OVCAR3细胞6天，用细胞划痕法测定细胞的运动能力，结果发现与对照组比较，经1,25(OH)2D3处理后细胞的运动能力明显减弱，并呈剂量依赖性，提示1,25(OH)2D3能明显抑制卵巢癌细胞迁移的能力。同时用Transwell实验检测10-7mol/L 1,25(OH)2D3对OVCAR3细胞迁移和侵袭能力的影响，结果显示与乙醇对照组比较，1,25(OH)2D3能明显抑制OVCAR3细胞的侵袭和迁移。为了进一步研究1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞向大网膜侵袭的抑制作用，该学者选取荧光素酶标记的OVCAR3细胞，将其与小鼠离体大网膜共培养，利用荧光素酶活性检测发现，与乙醇对照组比较，10-7mol/L 1,25(OH)2D3组的OVCAR3细胞在小鼠大网膜上定植的能力显着降低，提示1,25(OH)2D3能够抑制卵巢癌细胞向小鼠大网膜的侵袭。

四、维生素D对卵巢癌预后的影响

研究表明，检测维生素D水平可用来预测卵巢癌患者的预后。Webb等[28]收集了1006例卵巢癌血清标本(670例血清样本在诊断时收集，其余的336例在治疗后收集)，用COX比例风险模型评估血清25OHD与卵巢癌生存率之间的关系，结果发现卵巢癌患者诊断时的血清25OHD浓度与生存率密切相关， 在血清25OHD浓度分别为<25nmol/L，25.0～49.9nmol/L，50.0～74.9nmol/L，>75nmol/L的卵巢癌患者中，其5年总体生存率分别为39%、45%、51%、54%，提示卵巢癌患者的生存率随血清25OHD浓度的增加而升高；但未发现经治疗后的卵巢癌患者血清中测量的25OHD浓度与生存率的关系。Walentowicz-Sadlecka等[11]用电化学发光免疫法测定72例卵巢癌患者术前的血清25OHD浓度，并根据血清25OHD浓度将卵巢癌患者分成两组(25OHD<10ng/ml组和25OHD>10ng/ml组)，使用Kaplan-Meier生存曲线对其5年总体生存率进行分析，结果发现25OHD<10ng/ml组的卵巢癌患者中位生存期为28周，而25OHD>10ng/ml组的卵巢癌患者中位生存期为45周，提示血清25OHD浓度与好的预后密切相关。

综上所述，低维生素D与卵巢癌的发病风险相关，尤其是在超重和肥胖妇女中。卵巢癌患者中的维生素D水平较卵巢良性肿瘤和健康女性低。维生素D能明显抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移，促进卵巢癌细胞凋亡，并能预测卵巢癌的5年生存率。随着对维生素D抗肿瘤机制相关研究的不断深入，维生素D及其类似物可以为卵巢癌的治疗和预防提供新的思路。