环状RNA circ_0024707对乳腺癌细胞的生长和转移的影响

杨杰智 倪明立 徐 倩 杨明月 王 宁 吕红琼 黄 静

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发生率呈逐年上升趋势[1, 2]。早期乳腺癌患者经手术联合放化疗预后较理想，然而晚期乳腺癌患者目前尚缺乏有效治疗手段，寻找乳腺癌的早期诊断标志物和分子治疗靶点具有重要临床价值[3]。环状RNA(circRNA)是一类内源性非编码RNA，来源于前体信使RNA(mRNA)反向剪接[4]。circRNA的稳定性较高，可通过多种机制影响基因表达，参与调控细胞的生理活动[5]。越来越多的circRNA被发现在肿瘤细胞的生长、转移中发挥重要作用，影响肿瘤的发生、发展[6]。circRNA已成为乳腺癌分子研究领域的热点。hsa_circ_0024707是一种新发现的circRNA，尚未被报道研究过，其在乳腺癌细胞中的作用亦不明确。本研究通过检测hsa_circ_0024707在乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中的表达，并以乳腺癌细胞株为研究对象, 探讨hsa_circ_0024707对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制, 为circRNA分子靶向治疗研究提供实验依据。

材料与方法

1.材料：(1)临床标本：收集2016年3月～2018年7月于笔者医院行手术切除治疗的乳腺癌临床标本53例，包括乳腺癌组织和距离肿瘤边缘超过5cm的癌旁组织，术后均经病理医生确认为乳腺浸润性导管癌。患者年龄为28～65岁，平均年龄为46.89±8.52岁。组织学分级Ⅱ级18例，Ⅲ级35例，TNM分期T1期5例，T2期29例，T3期19例。患者术前均未行放化疗，本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准, 参与患者均签署知情同意。(2)细胞与试剂：人乳腺癌细胞株SKBR3、BT549、MCF7、MB-MDA-468、HCC1937和永生化乳腺上皮细胞MCF-10A购自中国科学院上海细胞库；实时定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒购自大连宝生物试剂公司；qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；载有hsa_circ_0024707的慢病毒和空载慢病毒由上海汉恒科技有限公司合成；小牛血清、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Costar公司；抗体(SPRY2、Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC、α-tubulin)、Matrigel基质胶购自美国BD公司。

2.细胞培养和慢病毒感染：人乳腺癌细胞株MB-MDA-468和永生化乳腺上皮细胞MCF-10A复苏后，培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，乳腺癌细胞株SKBR3、BT549、MCF7、HCC1937复苏后，培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养。将对数期生长的BT549细胞接种在6孔细胞板，细胞融合度为50%时，选择感染复数(MOI)=50，根据慢病毒说明书进行操作，采用慢病毒感染BT549细胞。12h后观察细胞状态并更换新鲜培养基。

3.实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测：采用Trizol法提取乳腺癌组织和乳腺癌细胞株总RNA，反转录合成cDNA后行qPCR检测。以GAPDH为内参基因，检测组织或细胞中hsa_circ_0024707和SPRY2 mRNA的相对表达量。以U6为内参基因，检测细胞中miR-448的相对表达量。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-448上游引物：5′-GGGCAGTGCGTGTCG-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；hsa_circ_0024707上游引物：5′-TGCACAGGGGAAGGAAATAA-3′，下游引物：5′-GATGATGGGGTTGCAAACTT-3′；SPRY2上游引物：5′-CCTACTGTCGTCCCAAGACCT-3′，下游引物：5′-GGGGCTCGTGCAGAAGAAT-3′。qPCR值采用2-ΔΔCt方法进行计算。

4.CCK-8检测：将感染后的BT549细胞接种于96孔板。CCK-8方法连续检测5天，绘制细胞生长曲线。检测时，每孔加5mg/ml的CCK-8试剂10μl，培养箱培养4h，每孔加150μl二甲基亚砜，SpectraMax plus384型全波长酶标仪检测每孔在波长450nm处的吸光度(A)值。

5.Transwell侵袭实验：采用Matrigel基质胶制备Transwell小室上室；将感染后的BT549细胞用血清培养基重悬后，接种于Transwell小室上室；下室加入含10%FBS的RPMI-1640培养基；培养24h后，取出上室，多聚甲醛固定10min，0.1%的结晶紫染液染色10min，棉签拭去上室未穿膜的细胞，PBS溶液漂洗；晾干后，采用倒置显微镜计数穿膜细胞数并统计。

6.生物信息学技术预测：starBase v2.0靶基因预测数据库预测hsa_circ_0024707的下游miRNA，TargetScan Release 3.1靶基因预测数据库预测miRNA的下游mRNA。

7.蛋白免疫印迹(Western blot)法：将感染后的BT549细胞裂解并提取总蛋白，采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜转膜，5%脱脂牛奶封闭1h。加入一抗SPRY2(1∶1000稀释)、Wnt(1∶2000稀释)、β-catenin(1∶500稀释)、GSK-3β(1∶2000稀释)、APC(1∶2000稀释)、α-tubulin(1∶3000稀释)，4℃孵育过夜，在室温下二抗孵育2h。ECL显影液在凝胶成像系统显影。

结 果

1.hsa_circ_0024707在乳腺癌组织中的表达：qPCR结果显示，hsa_circ_0024707在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达分别为1.73±0.46和4.53±0.76，hsa_circ_0024707在乳腺癌组织中呈低表达(P<0.05)。

2.hsa_circ_0024707在乳腺癌细胞中的表达：qPCR结果显示，hsa_circ_0024707在SKBR3、BT549、MCF7、MB-MDA-468、HCC1937细胞株和永生化乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达量分别为0.75±0.03、0.12±0.02、0.37±0.02、0.52±0.05、0.39±0.01和1.00±0.05，相比永生化乳腺上皮细胞MCF-10A，hsa_circ_0024707在乳腺癌细胞株中表达下调，差异均有统计学意义(P均<0.01)。hsa_circ_0024707在BT549细胞表达降低最明显(P<0.01)，故以BT549细胞为对象进行研究，详见图1。

图1 hsa_circ_0024707在永生化乳腺上皮细胞株和乳腺癌细胞株中的表达

3.qPCR检测感染后BT549细胞中hsa_circ_0024707的表达：qPCR结果显示，对照组和实验组乳腺癌BT549细胞中hsa_circ_0024707的表达分别为1.02±0.09和8.05±0.76，差异有统计学意义(P<0.01)，证明外源性hsa_circ_0024707在BT549细胞中成功表达。

4.hsa_circ_0024707对乳腺癌BT549细胞增殖的影响：采用CCK-8法检测hsa_circ_0024707过表达对 BT549细胞增殖能力的影响，与对照组比较，实验组BT549细胞从第3天开始，细胞增殖能力明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 hsa_circ_0024707过表达对乳腺癌BT549细胞增殖的影响

5.hsa_circ_0024707对乳腺癌BT549细胞侵袭的影响：采用Transwell侵袭实验检测hsa_circ_0024707过表达对 BT549细胞侵袭的影响，对照组和实验组BT549穿膜细胞数分别为82.46±8.49和38.34±8.84，差异有统计学意义(P<0.05)，证明hsa_circ_0024707过表达能抑制乳腺癌细胞BT549的侵袭，详见图3。

图3 hsa_circ_0024707过表达对乳腺癌BT549细胞侵袭的影响

6.生物信息学预测hsa_circ_0024707的下游基因：starBase v2.0靶基因预测数据库显示，hsa_circ_0024707靶基因可能为miR-448。TargetScan Release 3.1靶基因预测数据库显示，miR-448靶基因可能为SPRY2，详见图4。

图4 生物信息学预测hsa_circ_0024707的下游基因

7.qPCR检测感染后BT549细胞中miR-448和SPRY2 mRNA的表达：qPCR结果显示，对照组和实验组乳腺癌BT549细胞中miR-448的表达分别为1.00±0.07和0.27±0.05(P<0.01)，证明hsa_circ_0024707过表达可下调BT549细胞中miR-448的表达。对照组和实验组乳腺癌BT549细胞中SPRY2 mRNA的表达分别为1.01±0.07和5.16±0.30(P<0.01)，证明下调miR-448可上调BT549细胞中SPRY2 mRNA的表达。

8.hsa_circ_0024707过表达对乳腺癌BT549细胞SPRY2蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响：Western blot法结果显示，与对照组比较，实验组的 SPRY2蛋白表达上调，而Wnt/β-catenin信号通路蛋白Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC表达下调，详见图5。

图5 hsa_circ_0024707过表达对乳腺癌BT549细胞中SPRY2蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响

讨 论

环状RNA(circRNA)最初被认为是错误的剪接副产物，没有生物学功能[7]。随着高通量测序技术的发展，大量的circRNA被发现和鉴定，在多种肿瘤中发挥癌基因或者抑癌基因的作用[8]。近年来研究表明，circRNA的异常表达与乳腺癌的发生、发展相关[9]。circRNA如hsa_circ_0001982、circDENND4C、circ-ABCB10、hsa_circ_0008039在乳腺癌组织和细胞株中呈过表达，具有促进乳腺癌的恶性生物性行为的作用，与乳腺癌的不良预后相关[10～13]。circRNA如hsa_circ_0072309、MTO1在乳腺癌组织和细胞株中呈低表达，与乳腺癌的病理分期及预后等相关，具有抑制乳腺癌的增殖、迁移和侵袭的作用[8, 9]。hsa_circ_0024707是一个新发现的lncRNA，hsa_circ_0024707在乳腺癌中的表达和作用机制尚不明确。

本研究发现，hsa_circ_0024707在乳腺癌组织和细胞株中呈低表达，提示hsa_circ_0024707可能在乳腺癌中发挥抑癌基因作用。本研究进一步通过CCK-8实验和Transwell侵袭实验发现，hsa_circ_0024707过表达可明显抑制乳腺癌细胞BT549的增殖能力和侵袭能力，进一步提示hsa_circ_0024707在乳腺癌中发挥抑癌基因作用。有研究表明，circRNA含有miRNA反应元件，能通过海绵作用竞争性结合miRNA，下调miRNA的表达，从而调节miRNA下游基因mRNA的翻译[14]。starBase v2.0靶基因预测数据库显示，hsa_circ_0024707靶基因可能为miR-448。TargetScan Release 3.1靶基因预测数据库显示，miR-448靶基因可能为SPRY2。miR-448在胃癌、口腔鳞状细胞癌中表达明显升高，与患者的不良预后显着相关，发挥癌基因的作用[15,16]。

SPRY2蛋白由315个氨基酸构成，是一种潜在的抑癌蛋白，在胃癌、卵巢癌、神经胶质瘤等多种肿瘤中低表达，过表达SPRY2可抑制肿瘤的生长和转移[17，18]。本研究发现，hsa_circ_0024707在乳腺癌细胞BT549中过表达后，miR-448的表达明显下调，SPRY2基因的表达明显上调，表明hsa_circ_0024707可能通过下调miR-448的表达，促进SPRY2基因的表达。有研究表明，SPRY2可通过降低β-catenin蛋白的表达，发挥抑制肿瘤的生长和转移的作用[19]。Western blot法结果显示，乳腺癌细胞BT549中SPRY2基因表达增加后，Wnt/β-catenin信号通路蛋白如Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC的表达下调，Wnt/β-catenin信号通路的转导被抑制。

综上所述，本研究首次验证hsa_circ_0024707在乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中的表达下调，过表达hsa_circ_0024707可抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，其作用机制可能是hsa_circ_0024707通过下调miR-448的表达，促进SPRY2基因的表达，并抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导。hsa_circ_0024707可能成为乳腺癌治疗的分子靶标。