高书芬 苏 彬 李玉明 胡金朋
子痫前期是女性妊娠期特有的疾病,也是围生儿及孕产妇发生率与病死率的主要原因之一,其危险因素主要包括子宫胎盘功能障碍、自身免疫性疾病、葡萄胎、营养缺乏等[1]。而子痫前期对胎盘的影响会导致医源性早产、死产、羊水过少、宫内生长受限等;同时,子痫前期也会造成母体慢性高血压、缺血性心脏病、肝肾衰竭等,也是导致孕产妇死亡的主要原因,仅次于出血[2]。研究显示,子痫前期可能与滋养层细胞的侵袭性功能障碍具有相关性[3]。而长链非编码 RNA(long noncoding RNA,lncRNA) 是位于胞核或胞质中大于200个核苷酸的非编码RNA,研究显示,lncRNA与滋养细胞的功能具有重要的相关性[4]。子痫前期患者与正常妊娠患者比较,其胎盘中存在大量的差异性lncRNA,上调的lncRNA大约有15646个,下调的lncRNA大约有13178个,提示子痫前期可能与lncRNA具有相关性[5]。本研究通过前期先进行lncRNA 高通量测序检测,筛选出两组患者中lncRNA差异表达最大的为lncRNA,并拟进一步分析该差异lncRNA在滋养层细胞细胞功能中调控的分子机制,从而探讨其调控子痫前期的分子机制。
资料与方法
1.实验材料:选取2018年1～6月收治的子痫前期患者与健康产妇(各15例患者),设为子痫前期组与健康对照组。子痫前期组纳入标准:①孕产妇自然受孕且为单胎妊娠;②24h尿蛋白>0.3g或随机尿蛋白>1+;③妊娠 20 周后收缩压≥140mmHg和(或)舒张压≥90mmHg;④无蛋白尿,但新发高血压伴以下任一情况:肝功能损害、肾功能不全、视觉异常或神经系统异常、血小板减少症、肺水肿。健康对照组纳入标准:妊娠过程正常,胎儿发育正常,且无其他合并症或并发症。排除标准:①非自然受孕或多胎妊娠;②胎膜早破;③胎儿发育畸形或或羊水过多;④合并其他疾病;⑤胎盘位置或形态异常;⑥产后3个月患者依然高血压。本研究经笔者医院医学伦理学委员会审批通过(伦理学审批号:武人伦2017003)。
每组产妇中各随机选取9例患者胎盘组织进行高通量测序检测,筛选出表达差异最大的lncRNA ENST00000492363用于进一步的临床研究。其他实验材料还包括JEG-3细胞和HTR-8/Svneo细胞购自中国北纳生物科技有限公司;lncRNA ENST00000492363表达载体和空载购自中国中洪博元生物技术有限公司。
2.引物设计即荧光定量PCR检测:剖宫产取出胎盘样本后,进行清洗,并在30min内保存保存至-80℃冰箱中。通过数据库获得如下基因序列(表1),通用生物系统有限公司合成引物。荧光定量PCR检测:提取胎盘RNA组织后,利用紫外分光光度仪分别在A260和A280下分别进行计算数据,并计算RNA纯度及浓度:RNA浓度=A260×4(ng/μl),RNA纯度=A260/280(均在1.8～2.1范围内)。进行RNA反转录后,最后进行荧光定量PCR检测。
表1 基因序列及退火温度
3.构建lncRNA ENST00000492363过表达载体:①构建载体:查找基因序列后引入酶切位点(EcoRⅠ:GAATTC;BamHⅠ:GGATCC),合成目的基因片段后连接于pcDNA3.1(+)载体;②质粒转化DH5α,菌液扩大培养;③去内毒素大提质粒;④质粒酶切验证;⑤JEG-3细胞和HTR-8细胞传代;⑥载体转染:转染后,将JEG3和HTR-8培养细胞系,各分为3组:过表达ENST00000492363组(ENST00000492363组)、空白表达组(NC组)和正常组(control组)。
4.PCR检测各组JEG3、HTR-8细胞中ENST00000492363的表达水平:收集培养皿中的细胞,提取RNA后,测定RNA纯度及浓度:分别在A280、A260下测定数据,并计算RNA纯度、浓度:RNA纯度=A260/280(均在1.8～2.1范围),RNA浓度=A260×4(ng/μl)。最后RNA反转录后进行荧光定量PCR。
5.CCK-8检测各组JEG3、HTR-8细胞增殖水平:把转染以后JEG3、HTR-8细胞进行孵育后,最后通过酶标仪(450nm波长处)检测每孔细胞的吸光度值(A)。
6.流式细胞术检测各组JEG3、HTR-8细胞凋亡水平:各组均分别收集HTR-8、JEG3细胞(1～3)×106个,加入PBS离心后洗2遍,用Binding buffer将细胞重悬,再加入PI-PE以及Annenxin V-FITC,混匀后孵育10min,再加入Binding buffer,混匀后通过流式仪对细胞进行凋亡检测。
7.划线实验检测各组JEG3、HTR-8细胞的迁移能力:使用10μl枪头对每孔划痕,PBS清洗3次后更换为无血清培养基,先对每孔的划痕拍照,培养箱培养48h后再次进行拍照。分别测量0h及48h的划痕宽度,计算细胞的迁移速率[(0h划痕宽度-48h划痕宽度)/48h]。
8.Transwell实验检测各组JEG3、HTR-8细胞侵袭能力:将转染细胞离心,用培养基将细胞重悬并计数,每个小室细胞数为3×104个;在下室内加入完全培养基,上室细胞与培养基体积共约为300μl;48h后加入结晶紫染液,静置后擦去内室细胞拍照,最后洗脱后对小室染色水平进行检测。
9.Western blot法检测各组JEG3、HTR-8细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平:提取各组细胞的蛋白:加入细胞裂解液放置20min,将细胞刮到一侧后吸入EP管内,离心后的上清液中加入缓冲液,沸水煮5min测定各组蛋白浓度:将BSA标准品及待测蛋白样品分别加入不同管,分别再加入工作液BCA,混匀后孵育30min,通过全自动酶标仪测定标准品BSA及不同样品的吸光度值,最后计算样品内蛋白浓度。
10.各组蛋白电泳至曝光:把架子置入电泳液中,拔去齿梳后加入蛋白样品及marker;加入电泳液浸没胶板后开始电泳;剪好PVDF膜裁,甲醇激活;切好含有内参或目的条带的胶;按顺序依次将海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵放好,并进行转膜;使用脱脂牛奶封闭液封闭1h;加入一抗后过夜孵育;洗膜3次后加入二抗,孵育2h;洗膜3次后用发光液浸湿PVDF膜,最后显影成像。
结 果
1.正常妊娠和临床子痫前期患者胎盘组织的ENST00000492363表达:与健康对照组比较,子痫前期组的胎盘组织中ENST00000492363的表达显着降低(P<0.05),详见图1。
图1 PCR检测胎盘组织中lncRNA ENST00000492363的表达结果
2.滋养层细胞系HTR-8及JEG3中lncRNA ENST00000492363过表达水平:PCR检测ENST00000492363表达与过表达结果如图2所示。HTR-8细胞中,Cq(GAPDH)减去Cq(ENST00000492363)平均值为-17.61;JEG3细胞中,Cq(GAPDH)减去Cq(ENST00000492363)平均值为-12.67;因此,JEG3细胞中ENST00000492363的本底表达是HTR-8中的30.69倍。JEG3和HTR-8细胞中ENST00000492363表达载体的表达情况均良好。
图2 PCR检测ENST00000492363在JEG3、HTR-8细胞中表达及过表达结果A.ENST00000492363在JEG3细胞中的表达结果;B.ENST00000492363在HTR-8细胞中的表达结果。与control组比较,*P<0.05;与NC组比较,#P<0.05
3.ENST00000492363过表达对JEG3或者HTR-8细胞生长的影响:CCK-8检测结果显示,ENST00000492363组过表达的细胞增殖水平显着低于NC组及control组,表明ENST0000049236显着抑制细胞增殖水平(图3)。流式细胞术检测结果显示,ENST00000492363组过表达的细胞凋亡率显着高于NC组及control组,表明ENST0000049236促进细胞凋亡(图4)。
图3 各组细胞48h增殖水平CCK-8检测结果A.各组JEG3细胞48h增殖水平CCK-8检测结果比较;B.各组HTR-8细胞48h增殖水平CCK-8检测结果比较。与control组比较,*P<0.05;与NC组比较,#P<0.05
图4 流式细胞术检测各组JEG3、HTR-8细胞凋亡水平的结果A.各组JEG3细胞凋亡率的比较;B.各组HTR-8细胞凋亡率的比较。与control组比较,*P<0.05
4.JEG3、HTR-8细胞中过表达ENST00000492363对细胞迁移和侵袭的影响:划线实验检测结果显示,过表达ENST00000492363组的划线痕迹愈合速度显着低于NC组及control组,表明过表达ENST00000492363显着抑制了细胞迁移能力(图5)。Transwell实验检测结果显示,过表达ENST00000492363显着抑制了细胞侵袭能力(图6)。
图5 划线实验检测各组细胞迁移能力的结果A.JEG3细胞迁移能力比较;B. HTR-8细胞迁移能力比较。与control组比较,*P<0.05;与NC组比较,#P<0.05
图6 Transwell实验检测各组细胞侵袭能力的结果A.JEG3细胞A值的比较;B.HTR-8细胞A值的比较。与control组比较,*P<0.05;与NC组比较,#P<0.05
5.JEG3或HTR-8细胞中过表达ENST00000492363对E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平的影响:Western blot法检测结果显示,ENST00000492363过表达可抑制了细胞中Vimentin、N-cadherin的表达,并促进细胞中E-cadherin表达(图7)。
图7 Western blot法检测各组细胞中蛋白质E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平的结果A.JEG3细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平的比较结果;B.HTR-8细胞中蛋白质E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平的比较结果。与control组比较,*P<0.05;与NC组比较,#P<0.05
讨 论
子痫前期是妊娠相关的多系统疾病之一,是新生儿、胎儿及孕产妇病死率及发生率的主要原因之一,但其具体机制还不十分清楚[6]。每年子痫前期分别约占围生儿及孕产妇死亡的10%、15%[7]。研究显示,胚胎植入早期的滋养层细胞凋亡与增殖保持相对平衡,对子宫动脉重塑具有重要作用,可促进血管扩张、降低血流阻力,从而有利于血流供应并维持正常的侵袭与迁移能力[8]。而子痫前期患者的胎盘出现滋养层细胞凋亡增加、增殖能力减弱及侵袭性降低,最终引起子宫螺旋动脉重塑的异常及胎盘着床浅[9]。因此,滋养层细胞的异常可能与子痫前期患者的发病具有相关性。
近年来研究显示,lncRNA对滋养层细胞的功能具有直接的影响。PE患者与正常妊娠的胎盘组织内有大量表达差异的lncRNA,表明lncRNA与子痫前期可能具有一定的相关性,如子痫前期患者胎盘RPAIN表达上调后可通过对C1q的调节而促进滋养层细胞凋亡,并抑制其侵袭性,而促进子痫前期的发病[10,11]。而lncRNA PRNCR1表达上调则通过对丝裂原活化蛋白激酶信号通路进行调节,而影响滋养层细胞的功能[12]。lncRNA STOX2-IT3表达表达上调则通过对STOX2的表达调节,而对滋养层细胞的分化于侵袭水平产生抑制作用[13]。lncRNA LINC01410高表达可通过上调Fas表达,而促进滋养细胞的侵袭、增殖[14]。
lncRNA Linc00261高表达会通过抑制miR-558表达,间接抑制其对TIMP金属肽酶抑制剂4的调控表达,进而降低细胞的迁移、侵袭[15]。lncRNA uc003fir高表达则会与microRNA相互作用,且通过对CCL5直接调节而募集白细胞释放的促炎细胞因子与单核细胞,进而降低滋养层细胞侵入子宫肌层[16]。lncRNA SNHG5低表达则会减低其对miR-26a-5p/N-钙黏蛋白信号通路的作用,从而抑制细胞的侵袭、迁移、增殖[17]。lncRNA TUG1低表达则会影响MMP2、MCL1、VEGFA的表达,并通过抑制RND3与促进Ezh2表达而抑制螺旋动脉重塑,促进滋养层细胞凋亡,而减低细胞的侵袭、迁移、增殖[18]。
本研究通过发现子痫前期患者的临床胎盘组织内ENST00000492363表达低于正常胎盘组织,滋养层细胞系JEG3和HTR-8被用于进一步研究。PCR检测结果表明,ENST00000492363在HTR-8细胞中的本底明显低于JEG3细胞。而ENST00000492363过表达后,HTR-8 与JEG3细胞凋亡率显着上升、且细胞增殖抑制,细胞的侵袭及迁移能力均显着下降。另外有研究显示,上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)对滋养层细胞的分化、转移具有关键性的作用。本研究通过对HTR-8 与JEG3细胞内的EMT的标志性基因Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白质的表达检测,结果显示滋养层细胞系HTR-8、JEG3中ENST00000492363过表达,会显着上调蛋白质E-cadherin的表达,并抑制蛋白质Vimentin、N-cadherin的表达,表明ENST00000492363对滋养层细胞EMT具有显着的抑制作用,这也进一步验证了ENST00000492363对滋养层细胞侵袭、迁移能力的抑制作用。
本研究中ENST00000492363对滋养层细胞增殖的抑制作用及凋亡的促进作用,可能与ENST00000492363对CASP10基因表达的促进作用相关,进而导致蛋白质caspase-10表达上升,促进细胞凋亡上升,这也可能是细胞中EMT被抑制的原因之一。
综上所述,基因CASP10表达的lncRNA ENST00000492363对滋养层细胞有显着的调控作用,会显着抑制滋养层细胞的侵袭及迁移能力,并抑制上皮-间充质的转化过程,同时可显着抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。
