王会妍 糜若然 张云山
超排卵技术是提高体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）妊娠率的方法之一，然而不同个体的卵巢对外源性促性腺激素（gonadotropin，Gn）反应不同，卵巢低反应以超排卵后获卵数目少和血雌二醇（E2）峰值低为特征，发生率约为12%~30%[1]，易导致治疗周期取消和低妊娠率，是体外受精（IVF）中的难题。生长分化因子（growth differentiation factor，GDF）-9作为卵源性生长因子，通过自分泌及旁分泌机制对调节卵泡的发育及卵巢功能，调控优势卵泡的形成及稳定卵母细胞微环境有重要作用。本研究应用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR）技术检测不孕症患者超排卵周期卵泡颗粒细胞GDF-9的表达情况，旨在探讨GDF-9与卵巢低反应的关系，以期提高获卵率。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选 取2009年5月—2010年1月因男性因素不孕就诊于天津市中心妇产科医院生殖医学中心行卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的女性患者70例，平均年龄（30.62±4.67）岁，标本均获得患者知情同意后采集。纳入标准：年龄<40岁，基础卵泡刺激素（FSH）<10 IU/L，催乳素正常范围，月经周期规律，近3个月内未接受过促排卵治疗者。排除标准：多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、甲状腺功能异常及卵巢手术史者。
1.2 方法
1.2.1 超排卵方案及分组 采用常规长方案控制性超排卵，于前次月经周期基础体温上升后第7天，即黄体高峰期开始应用促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa），皮下注射曲普瑞林注射液0.05 mg/d，下一月经周期第3~5天据患者年龄和B超提示卵巢体积、窦状卵泡数肌注Gn，包括重组卵泡刺激素（rFSH，商品名：果纳芬）和尿促性腺素（HMG），于周期第8天起行阴道B超监测卵泡发育，据E2水平及阴道超声观察卵泡发育情况调整剂量，当优势卵泡平均直径达18 mm或有3个卵泡平均直径达16 mm时停用，当晚肌注绒毛膜促性腺素（HCG），36 h后阴道B超引导下穿刺取卵。依据取卵时获得平均直径>14 mm的卵泡数目进行分组[2]：卵泡数≤5个为卵巢低反应组，6~19个为中反应组，≥20个为高反应组。
1.2.2 标本采集 留取患者卵泡穿刺液经2 000 r/min离心10 min，弃上清，细胞沉淀物用PBS配成悬液，以1∶1的比例将细胞悬液缓慢加入到percoll分离液上，以2 000 r/min离心20 min，吸取颗粒细胞层，含有少量红细胞，用红细胞裂解液洗涤、溶解红细胞。然后经PBS洗涤去除红细胞裂解液。并于取卵后4 h解剖显微镜下留取MⅡ期卵母细胞的卵丘颗粒细胞，吹打分散细胞团，2 000 r/min离心10 min，经PBS洗涤。获得的卵泡壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞最后均加入Trizol分别置1.5 mL EP管中，经液氮快速冷冻后于-80℃冰箱备用。
1.2.3 Real-time PCR 颗粒细胞总RNA提取依据Trizol法操作，取总RNA 2 μg逆转录（RT），取 2 μL RT 产物使用Roche Light Cycler定量PCR仪，进行Real-time PCR（SYBR Green荧光染料购自TOYOBO公司），目的基因GDF-9引物序列为：上游5′-CAGGCTCCTGGAGACCAGGTAA-3′；下游5′-TT GCACACACATTTGACAGCAGA-3′，产物长度为158 bp。以GAPDH为内参，其上、下游引物序列分别为：5′-CCAG CAAGAGCACAAGAGGAA-3′，5′-GGTTGAGCACAGGGTACTT TATT-3′，产物长度为181 bp。总反应体系20 μL，反应参数：95℃预变性5 min，95℃ 1 0 s，58℃ 1 0 s，72℃ 1 0 s，进行40个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳无引物二聚体和非特异扩增产物出现。通过实时监测PCR产物的动态积累量，得到各管标本的扩增曲线及目的序列的Ct值，同时检测该管标本管家基因GAPDH的Ct值，计算各管标本待测序列的△Ct值（△Ct=目的序列的Ct值-该管样品GAPDH的Ct值），该管标本目的序列的相对表达量为2-ΔCt值。
1.3 统计学方法 应用SPSS 12.0统计软件，计量资料以±s表示，多组均数比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q法分析，两变量间相关性采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 卵巢不同反应组患者临床资料比较 70例IVF患者中卵巢低反应组21例，中反应组25例，高反应组24例；各组患者的年龄、不孕年限、基础FSH、E2水平、Gn用量比较差异均无统计学意义（均P>0.05），见表1。
表1 卵巢低、中、高反应组间临床资料比较 （±s）
表1 卵巢低、中、高反应组间临床资料比较 （±s）
均P>0.05
低反应组中反应组高反应组F 21 25 24年龄（岁）31.86±5.33 30.42±4.79 30.25±5.15 1.126不孕年限（a）4.30±2.69 4.85±3.01 4.55±2.83 0.947 FSH（IU/L）5.59±1.49 6.03±1.62 5.42±1.94 0.873 E2（nmol/L）78.55±32.64 80.61±38.70 76.16±37.38 1.009 Gn用量（IU）2 330.3±688.5 2 211.8±677.3 2 173.5±752.3 1.107组别 n
2.2 卵巢不同反应组颗粒细胞GDF-9基因表达情况 在患者卵泡壁颗粒细胞及卵丘颗粒细胞中均有GDF-9 mRNA表达，3组比较差异有统计学意义（P<0.05）。低反应组卵泡壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞的GDF-9 mRNA相对表达量均低于中反应组及高反应组（均P<0.05），见表2。
2.3 GDF-9表达与超排卵获卵数的相关性 卵巢低、中、高反应组的获卵数分别为：（3.43±0.98）、（12.21±3.59）、（24.95±5.94）个。卵泡壁颗粒细胞、卵丘颗粒细胞GDF-9 mRNA表达量与超排卵获卵数呈正相关（r分别为0.508、0.632，均P<0.01）。
表2 卵巢低、中、高反应组GDF-9 mRNA表达情况（±s）
表2 卵巢低、中、高反应组GDF-9 mRNA表达情况（±s）
*P<0.05，**P<0.01
低反应组（1）中反应组（2）高反应组（3）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）21 25 24卵泡壁颗粒细胞表达量（×104）18.64±8.35 23.68±6.27 32.75±13.98 4.551*3.590*4.819**3.051*卵丘颗粒细胞表达量（×104）19.29±9.32 26.44±12.17 38.06±14.28 4.742*2.994*6.752**3.698*组别 n
3 讨论
GDF-9属于转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族，是首个被发现的卵母细胞来源的生长因子[3]，其基因定位于人染色体5q31.1，包含2个外显子及1.6 kb的内含子。GDF-9具有促进卵泡募集和增加排卵率的作用，并通过调节颗粒细胞的功能，参与调节卵泡生长的微环境。
GDF-9和FSH都能刺激卵泡的发育，GDF-9主要作用于原始和初级卵泡，而FSH主要促进次级卵泡及以后阶段的卵泡发育。GDF-9的重要靶细胞是颗粒细胞，其可刺激颗粒细胞的增殖，进而促进窦前卵泡的发育，亦能调节FSH在颗粒细胞中的作用[4]。本研究应用Real-time PCR技术检测IVF-ET患者超排卵周期颗粒细胞GDF-9 mRNA的表达，结果显示GDF-9 mRNA在超排卵患者的卵泡壁颗粒细胞及卵丘颗粒细胞中均有表达，且表达水平与卵巢低反应程度有关。卵巢低反应患者GDF-9 mRNA表达量低，卵泡发育少；而高反应患者GDF-9表达量高，获卵数多，二者呈正相关关系，证实了GDF-9的表达对卵泡发育起重要作用。Kobayashi等[5]发现GDF-9反义核苷酸可降低FSH受体的mRNA水平，抑制了基础状态（无FSH）和FSH刺激下的窦前卵泡生长，而该抑制作用可被外源性GDF-9拮抗，加入GDF-9后卵泡的发育数增加。GDF-9通过调节FSH受体与G蛋白的偶联和FSH受体水平来调控FSH的作用，抑制FSH诱导产生环磷酸腺苷（cAMP），从而影响卵泡发育。对仓鼠的实验发现FSH可上调GDF-9的表达，该作用可被GDF-9的小干扰RNA（siRNA）完全抑制[6]。以上研究提示，足量的GDF-9是FSH调控卵泡发育必需的，且FSH受体的mRNA表达亦需要足够的GDF-9，GDF-9表达降低或是缺陷可能导致FSH受体异常，对FSH反应降低，影响窦前期和早窦期的卵泡生存与生长，从而导致超排卵周期的卵巢低反应。
Mottershead等[7]报道人原始卵泡在无血清的培养液中培养7 d后，重组GDF-9处理的原始卵泡有53%达到初级阶段，而不存在重组GDF-9条件下的对照组只有31%达到初级阶段，并且用GDF-9处理的卵泡成活力也明显提高。应用重组GDF-9能增加初级卵泡的数量，减少卵泡的闭锁，并抑制FSH引起的黄体生成素（LH）受体、E2、孕酮黄体酮（P4）的生物合成，GDF-9能通过颗粒细胞，刺激抑制素的产生、抑制素亚单元mRNA的表达和抑制素a启动子的活性。GDF-9可促进FSH非依赖期的卵泡生长，在FSH依赖期与FSH协同作用，刺激卵泡生长及抑制卵泡过早黄素化。GDF-9能极大地影响FSH的作用，因此卵巢内GDF-9与Gn相互作用对卵泡生长发育的调控已成为近年研究的热点。
GDF-9是卵泡发育过程中不可或缺的生长因子，本研究发现其mRNA表达水平降低与IVF超排卵周期卵巢低反应有关。对于超排卵反应低下的患者，可尝试应用重组GDF-9刺激初级卵泡生长，增加对Gn敏感的窦前卵泡，与rFSH协同调节卵泡发育，改善卵巢功能。可以减少Gn的用量，使得促排卵方案更加合理，为不孕症患者利用自身卵母细胞提供可能性，为治疗卵巢低反应提供新方法。
[1]Akande VA,Keay SD,Hunt LP,et al.The practical implications of a raised serum FSH and age on the risk of IVF treatment cancella⁃tion due to a poor ovarian response[J].Assist Reprod Genet,2004,21(7):257-62.
[2]Kansal Kalra S,Ratcliffe S,Gracia CR,et al.Randomized con⁃trolled pilot trial of luteal phase recombinant FSH stimulation in poor responders[J].Reprod Biomed Online,2008,17(6):745-750.
[3]Huang HY,Wang HS,Chan SH,et al.Granulosa-lutein cell growth differentiation factor-9(GDF-9)messenger RNA and protein ex⁃pression in in vitro fertilization(IVF)cycles:relation to characteris⁃tics of ovulation induction and IVF[J].Fertil Steril,2009,91(4):1583-1585.
[4]Orisaka M,Tajima K,Tsang BK,et al.Oocyte-granulosa-theca cell interactions during preantral follicular development[J].Ovarian Res,2009,2(1):9.
[5]Kobayashi N,Orisaka M,Cao M,et al.Growth differentiation fac⁃tor-9 mediates follicle-stimulating hormone-thyroid hormone inter⁃action in the regulation of rat preantral follicular development[J].Endocrinology,2009,150(12):5566-5574.
[6]Wang C,Roy SK.Expression of growth differentiation factor 9 in the oocytes is essential for the development of primordial follicles in the hamster ovary[J].Endocrinology,2006,147(4):1725-1734.
[7]Mottershead DG,Pulkki MM,Muggalla P,et al.Characterization of recombinant human growth differentiation factor-9 signaling in ovarian granulosa cells[J].Mol Cell Endocrinol,2008,283(1-2):58-67.
