姚卫锋卢桂玲谢艳秋于旺宋蒙蒙李士颖
衣原体噬菌体Vp2蛋白的生物临床价值分析
姚卫锋1卢桂玲1谢艳秋1于旺1宋蒙蒙1李士颖2△
目的明确衣原体噬菌体Vp2蛋白在病毒重组、筛查研究中的作用，评估Vp2的临床价值。方法以COBALT程序在线比对各株衣原体噬菌体衣壳蛋白Vp2蛋白序列；并以ProteinBlast的Distance tree功能构建种系发生树。以高保守区氨基酸序列为基础，采用Gamier-Robson法、Chou-Fasman法分析蛋白二级结构；以Karplus-Schulz法分析柔性区域；Kyte-Doolittle法、Hopp-Woods法分析亲水性；Emini法分析表面可及性；Jameson-Wolf法分析抗原指数。结果6株衣原体噬菌体Vp2蛋白序列高度保守，差异主要在Chp1与其他5株噬菌体的Vp2蛋白之间亲缘关系较远。各株噬菌体的Vp2蛋白均有α螺旋为主的二级结构，蛋白序列高保守区存在多个细胞表位。结论Vp2蛋白性质保守，是衣原体噬菌体衣壳的重要组分。其蛋白分子结构复杂，高保守区有较强的免疫原性，在病毒重组、沙眼衣原体噬菌体野生株筛查研究中有实际研究价值。
微病毒属；衣原体科；细菌噬菌体；蛋白质类；计算生物学
衣原体为胞内寄生菌，可经眼、呼吸道、泌尿生殖道黏膜感染，易感难治，多年来感染病例仍不断增加。随着细菌噬菌体研究的复兴[1-2]，近年发现的衣原体噬菌体为衣原体研究开辟了新领域[3]。衣原体噬菌体是一类以衣原体为宿主的病毒[4]。病毒蛋白2（virus protein2，Vp2）是构成衣原体噬菌体衣壳的三种结构蛋白之一，核衣壳成熟过程中Vp2参与病毒装配[5]。本文以衣原体的各株噬菌体Vp2蛋白序列为目标，分析Vp2的共同特点，利用获得的生物信息评估Vp2的潜在研究价值。
1 材料与方法
1.1 材料各株衣原体噬菌体Vp2蛋白氨基酸序列Gen-Bank序列号分别为Chlamydiaphage1 Vp2（Chp1Vp2，NP_ 044314.1）、Chlamydiaphage2 Vp2（Chp2Vp2，NP_054650.1）、Chlamydiaphage3 Vp2（Chp3Vp2，YP_022482.1）、Chlamydiaphage4 Vp2（Chp4Vp2，YP_338241.1）、Chlamydia pneumoniae phage CPAR39 Vp2（phiCPAR39，NP_063896.1）、Guinea pig Chlamydia phage Vp2（phiCPG1，NP_510874.1）。
1.2 方法以COBALT程序在线比对（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi）各株衣原体噬菌体衣壳蛋白Vp2序列；并以ProteinBlast的Distance tree功能构建种系发生树。以高保守区氨基酸序列为基础，采用Gamier-Robson 法[6]、Chou-Fasman法[7]分析蛋白二级结构；以Karplus-Schulz法分析柔性区域；Kyte-Doolittle法[8]、Hopp-Woods法[9]分析亲水性；Emini法分析表面可及性；Jameson-Wolf法[9]分析抗原指数。
2 结果
2.1 序列高保守区比对结果6株衣原体噬菌体Vp2蛋白序列除衣原体噬菌体Chp1的Vp2蛋白由263个氨基酸残基（a.a）组成外，其他5株的Vp2蛋白都包含186个a.a。比对发现：Chp1Vp2在N端a.a第1～37（37 a.a），193～213（20 a.a），245～263（18 a.a）节段与其他5种Vp2蛋白存在长距离“空沟”，见图1（以短横线“-”表示），其长度为上述3节段全长；同时在第125、156、163、239位出现单个a.a长度的比对空沟。分析各株Vp2的种系发生关系显示：Chp1Vp2与其他5株亲缘关系较远，为单独一组；其余5株关系较近，为一组，同时又分为两个亚组：phiCPG1和另4株噬菌体，见图2。以种系发生关系为指导，去除Chp1Vp2序列后行序列比对分析，发现5株噬菌体的Vp2蛋白无比对空沟，序列构成及残基排列高度一致：以COBALT程序网上比对发现一致度最低为98％，见图1。
2.2 保守区二级结构分析结果鉴于不同蛋白质的氨基酸序列有30％以上的相似性即可认为其结构相似[10]，本文以衣原体噬菌体Chp4的Vp2蛋白为代表，分析5株高度相似的衣原体噬菌体（即除去Chp1的其他5株衣原体噬菌体）的Vp2蛋白的二级结构。Chou-Fasman方案和Gamier-Robson方案均示：序列全长范围频繁出现长片段α螺旋（Alpha Regions），而β折叠（Beta Regions）结构只有3个，散在分布。转角结构（Turn Regions）分散排布于上两者之间，数量不多。两种方案显示的α螺旋位置大部分重合；但β折叠位置有冲突，一致度高的位置为氨基酸残基N端第25～37区间。两方案分析转角结构与柔性区域（Flexible Regions,Karplus-Schulz方法）的位置基本重叠，柔性区域为N端第5～13、36～ 45、56～63、69～74、82～91、95～102、105～108、115～120、125～132、135～138、140～143、145～150、162～175，占全部氨基酸残基的43.4％。说明有较多位置存在潜在的细胞表位。Gamier-Robson方案示：无规卷曲结构（Coil Regions）数量少而分散，位置上同样与柔性区域基本重叠，见图3。综合上述：α螺旋位置为N端第3～7、34～57、62～73、77～81、101～104、115～135、144～154、158～165、175～181，为全部氨基酸残基的47.3％；β折叠位置为N端第26～36，占全部氨基酸残基的5.3％。说明Vp2蛋白二级结构以α螺旋为主。转角结构位置为N端第58～62、84～86、89～94、137～142。
Fig.1 The sequences alignment of six Vp2 proteins图1 6株衣原体噬菌体的Vp2蛋白序列比对
2.3 B细胞表位预测结果Kyte-Doolittle和Hopp-Woods方案分析蛋白亲水性显示亲水区域基本重叠，蛋白亲水性较高的区域（Hydrophilicity Plot）为N端第3～8、35～43、46～50、57～62、84～90、93～100、112～121、125～135、140～153、178～186，见图3。Jameson-Wolf法预测抗原指数（Antigenic Index）较高的区域为N端第1～8、3～74、83～92、95～105、110～52、157～168、170～177、180～186，见图3。高抗原指数区域与预测的亲水区重合度良好。Emini方案预测氨基酸残基蛋白质表面可及性（Surface Probability Plot），显示N端第5～13、35～46、56～62、68～73、82～91、95～101、105～108、115～119、123～132、134～137、139～142、146～ 150、160～174、180～183区段表面可及性良好，见图3。
Fig.2 The phylogenetic tree of six Vp2 protein sequences图2 6种Vp2种系发生树
3 讨论
3.1 衣原体噬菌体Vp2蛋白的生物多态性Vp2蛋白是衣原体噬菌体衣壳蛋白的三种成分之一，与其他两种蛋白以固定比例构成噬菌体的正20面衣壳，是噬菌体包装成熟过程中不可或缺的蛋白成分。鉴于没有Vp2相关蛋白的晶体结构衍射分析，其三维结构不明。因而本文通过分析Vp2蛋白的一级结构，从理论上反复论证以获得Vp2蛋白更多的结构及相应的功能信息。对目前发现的全部6株噬菌体Vp2蛋白序列的分析，揭示了Vp2蛋白的氨基酸残基构成及排列均有明显的一致性。虽然出现了3段长距离空沟及4个单残基长度空沟，比对差异颇为明显，而这种差异是因为Chp1Vp2序列与其他5株Vp2序列的差异引起的。理论上，蛋白的生物多态性应该更为复杂，虽然都是衣原体噬菌体的Vp2蛋白，但不同衣原体噬菌体的蛋白必然有其自身特点。而6株Vp2蛋白的种系发生关系进一步清晰了衣原体噬菌体Chp1株的Vp2蛋白与其他5种Vp2蛋白差异的原因——Chp1Vp2与其他5株亲缘关系较远。实际上，上世纪80年代发现的第一株衣原体噬菌体Chp1并没引起关注[10]。比对其余5种Vp2序列发现有98％～100％的一致性。比对结果表明：Vp2蛋白在进化过程中高度保守，尤其相对Chp1Vp2的 263个氨基酸残基，其余五种来自不同衣原体噬菌体的Vp2蛋白的186个氨基酸残基从组成种类、数量及排列次序上保守性很高。进一步，即使相对亲缘关系较远的Chp1Vp2也在序列中包含了这186 a.a（即使相应位置的氨基酸残基不同，但性质相似）。这在频繁发生突变的简单微生物种类——病毒中足以引起重视[11]，Vp2蛋白保守性极高，并没表现出明显的生物多态性。因而可以认为Vp2在噬菌体组装成熟过程中有不可替代的功能，以至于其可能的突变（理论上应该有较高突变率）将影响噬菌体的生活过程——核衣壳的成熟，这样可能的突变株不易存活。因此，Vp2蛋白就具备了通用标志物的特点，以其为筛查目标，将极大提高衣原体噬菌体筛查的灵敏度，这对于在衣原体中，尤其是在沙眼衣原体中寻找噬菌体提供了合理的理论支持。
Fig.3 The prediction map of secondary structure and B cell epitope图3 二级结构及B细胞抗原表位预测图
3.2 衣原体噬菌体Vp2蛋白的二级结构及细胞表位通过序列比对，发现的长度为186 a.a蛋白序列仍有必要进一步挖掘其生物信息，并从这些信息中获得研究指导和提示。在晶体结构不明的情况下，应用生物信息工具分析其二级结构及细胞表位的研究方法已经为研究者所接受[7-8]：随着分析工具的不断完善，多方案分析汇总后的结果与实证结构的符合率不断提高。总原则为：两种或两种以上不同原理的预测方案共同认可的预测结果将被采信。本文通过不同预测方案的交叉应用，分析了代表高保守186 a.a蛋白序列的Chp4Vp2蛋白序列。研究中普遍认为α螺旋、β折叠这两种结构很少能形成细胞表位[7-9]，因而在最终结果分析中剔除上述区间的预测表位。反之，对位于无规卷曲和转角结构这两种极可能形成细胞表位的结构区的预测表位，则在预测中保留，并进入下一步评估。进一步通过对亲水性、表面可及性、抗原指数指标的逐次筛选——满足高亲水性、高表面可及性和高抗原指数要求后，本研究认为氨基酸残基序列N端第1～6、57～61、83～89、93～99、112～117、181～186区间为Vp2蛋白的优势B细胞表位。以这些预测表位为基础，将大大简化后续核酸、蛋白合成步骤，节省研究时间及经济成本。
相对种系发生晚的流产衣原体、豚鼠结膜炎衣原体等较新的衣原体都已发现了自身的噬菌体，从进化角度推测，种系发生较早的沙眼衣原体也是临床关注度最高的衣原体，很可能存在自己的噬菌体。目前发现的总计6株衣原体噬菌体各以一种或几种衣原体为宿主，并且噬菌体宿主谱间有交叉重叠[10]。这表明可以从沙眼衣原体之外的其他衣原体中寻找能感染沙眼衣原体的噬菌体。以上两方面都需要以目前发现的衣原体噬菌体为基础，通过其某种共性来寻找新的衣原体噬菌体。Vp2蛋白的高保守性、多优势表位的可选择性顺应了这个要求，因而是很好的标志蛋白。
本文分析了全部6株衣原体噬菌体的Vp2蛋白氨基酸序列，证明各株噬菌体的Vp2蛋白一致度很高，性质保守。序列的高保守区中有6个优势B细胞表位并获得各个表位的具体位置及氨基酸构成信息。明确了该蛋白在病毒重组、沙眼衣原体噬菌体野生株筛查研究中有重要价值。6株衣原体噬菌体中的5株是近10余年发现的，该领域研究亟待拓展，并由此推进衣原体疾病的基础研究。
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（2013-11-25收稿2013-12-30修回）
（本文编辑李鹏）
The Clinical Value of Chlamydia Phage Vp2 Protein
YAO Weifeng1，LU Guiling1，XIE Yanqiu1，YU Wang1，SONG Mengmeng1，LI Shiying2
1 Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital,Tianjin 300120，China；2 Tianjin Gongan Hospital LI Shiying，E-mail:lishiyingmed@sohu.com
ObjectiveTo evaluate the effect of chlamydiaphage virus protein 2(Vp2)on the recombinant virus and virus screening research,and it clinical value thereof.MethodsTo compare the Vp2 protein sequences to get the conservative region with COBALT.A phylogenetic tree was built with ProteinBlast of Distance tree.The amino acid sequence in the high conservative region was predicted by the methods of Gamier-Robson and Chou-Fasman,and its flexibe regions were predicted by Karplus method.The hydrophilicity plot was predicted by Kyte-Doolittle and Hopp-Woods method.The surface probability was analysed by Emini,and the antigenic index was analysed by Jameson-Wolf method.ResultsThe six Chlamydiaphage Vp2 proteins were the highly conserved sequences.There were obvious differences between Chp1Vp2 and other 5 Vp2 proteins.There were the main structure-alpha helix and some cell epitopes in the high conserved region.ConclusionVp2 protein is the important component of chlamydia phage capsid with the conservative nature.Vp2 protein has complicated structures and high conservative region with strong immunogenicity,playing a practical value of research in virus recombinantment and screening the wild strains of chlaymdia trachomatis phage.
microvirus；chlamydiaceae；bacteriophages；proteins；computational biology
R373.9
A
10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.003
天津市中医药管理局科技基金资助项目（13017）
1天津市中医药研究院附属医院（邮编300120）；2天津市公安医院
△通讯作者E-mail:lishiyingmed@sohu.com
