刘金剑，张玉民，杨翠红，褚丽萍，黄帆，高红林，刘鉴峰
酸敏感阿霉素前药纳米粒的合成及其在治疗脑胶质瘤中的作用
刘金剑#，张玉民#，杨翠红，褚丽萍，黄帆，高红林，刘鉴峰△
摘要：目的合成一类新的具有酸敏感性能的阿霉素前药纳米粒（PEG-DOX NPs），对其结构进行表征，并研究其在体外抗脑胶质瘤中的作用和透过血脑屏障的效率。方法通过席夫碱反应合成具有酸敏感的聚乙二醇-阿霉素（PEG-DOX）单体，通过自组装制备PEG-DOX NPs。利用动态光散射（DLS）和核磁对单体进行结构表征，通过透射电镜（TEM）对纳米粒的微观形貌进行观察，紫外检测法测定PEG-DOX NPs在酸性条件下的释放行为，荧光显微镜观察脑胶质瘤细胞对PEG-DOX NPs的摄取行为。利用MTT法测定PEG-DOX NPs与阿霉素（DOX）对脑胶质瘤细胞的杀伤作用。PEG-DOX NPs修饰吐温80（PS-80）获得PS80-PEG-DOX NPs。将9只BALB/c小鼠随机均分为Free DOX组、PEG-DOX NPs组和PS80-PEG-DOX NPs组，利用小动物活体成像系统比较其修饰前后脑及主要脏器内DOX的荧光强度。结果PEG-DOX能够自组装成直径100 nm左右的纳米粒；在酸性条件下PEG-DOX NPs能够快速释放DOX，肿瘤细胞对PEG-DOX NPs的摄取虽然比DOX慢，但蓄积时间更长；PEG-DOX NPs和Free DOX 对C6细胞的增殖抑制均呈现浓度依赖性，PEG-DOX NPs组细胞增殖抑制率在各个浓度下均低于Free DOX组。PS-80修饰后，PS80-PEG-DOX NPs透过血脑屏障的效率显着高于DOX和PEG-DOX NPs组。结论PEG-DOX NPs具有良好的体外抗肿瘤作用，修饰后可高效透过血脑屏障，使其体内治疗脑胶质瘤成为可能。
关键词：血脑屏障；阿霉素前药；纳米粒；脑胶质瘤；酸敏感
#共同第一作者
脑胶质细胞瘤简称脑胶质瘤(Brain glioma)，是中枢神经系统（CNS）最常见的肿瘤，发病率约为12/100 000，据文献报道其在颅内肿瘤中所占比例为35%～60%[1-2]，是严重危害人类健康的疾病之一。血脑屏障（BBB）是治疗脑胶质瘤疾病中遇到的最大瓶颈，其作为邻近内皮细胞的紧密连接可以阻挡分子质量大于500 u的物质进入脑中，仅能使小分子通过被动扩散的方式进入CNS[3]。膜表面存在的特异性转运系统能够使营养物质进入脑内，同时能够阻止潜在的损害CNS的毒性物质进入。BBB为保护脑组织的内环境稳态和CNS的正常生理功能提供了保障；然而这一屏障的存在也阻碍了治疗药物的输送，为脑胶质瘤的诊断和治疗带来了极大的挑战。本实验针对脑胶质瘤设计并合成了具有酸敏感的前药纳米粒，通过体外包吞试验和细胞毒性试验，探讨其抗肿瘤作用；并探讨经修饰后的阿霉素前药纳米粒（PEG-DOX-NPs）能否有效透过BBB，进而为体内抗肿瘤试验和临床治疗脑胶质瘤提供指导和实验依据。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂与动物醛基化聚乙二醇（mPEG-CHO，分子质量为2 000 u）购自北京键凯科技有限公司；盐酸阿霉素（DOX-HCL）购自浙江海正药业股份有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自美国Sigma公司；其他化学试剂均购于希恩思生化科技有限公司。大鼠神经胶质瘤C6细胞系由南开大学孔德领教授惠赠。BALB/c小鼠，SPF级，雌性，平均体质量（20.0±0.5）g，购自军事医学科学院[许可证号：SCXK- (军) 2007-004]。所有动物实验均遵循《实验动物保护条例》。
1.1.2主要仪器动态光散射粒度仪（Zetasizer Nano ZS90，Malvern Instruments,英国）；1H核磁共振波谱仪（VARIAN Unity Plus 400mHz，Varian Instruments，美国）；透射电子显微镜（TEM；Tecani G2 F20系统，FEI，美国）；全波长酶标仪（VARIOSKAN FLASH，Thermo scientific，美国）；活细胞工作站（DMI6000B，Leica，德国）；小动物活体成像系统（IS In Vi⁃vo FX，Care-streamhealth公司，美国）。
1.2方法
1.2.1前药纳米粒单体的合成及表征称取200mg分子质量为2 000 u的mPEG-CHO和50mg经质子化的阿霉素（DOX）[4]，将其共溶于2.0mL二甲基亚砜（DMSO）内，加入20 μL三乙胺（Et3N）作为催化剂，40℃水浴条件下震荡反应24h，得到聚乙二醇-阿霉素（Polyethylene glycol-DOX, PEGDOX）。将反应液置于截留分子质量为1 ku的透析袋内，DMSO作为透析液，透析48h以除去未反应的DOX；再将透析液更换为pH 7.4的PBS溶液，透析48h以除去DMSO。将得到的酸敏感的前药纳米粒单体水分散液冻干，得到可再分散的冻干粉。通过1H核磁共振对PEG-DOX单体结构进行表征。
1.2.2PEG-DOX NPs的自组装及形貌观察称取PEGDOX冻干粉30mg溶于2mL DMSO内，将溶液缓慢逐滴加入盛有10mL PBS（pH 7.4）的烧杯内，不断震荡。最后将混合溶液置于截留分子质量为3.5 ku的透析袋内，PBS（pH 7.4）作为透析液，透析48h以除去未组装的PEG-DOX和有机溶剂DMSO，得到前药纳米粒PEG-DOX NPs。通过TEM观察PEG-DOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h后的形貌特征。
1.2.3药物释放分别取2mL浓度为5.0 g/L的DOX和PEG-DOX NPs装入截留分子质量为3.5 ku的透析袋中，并分别置于装有50mL PBS（pH 7.4）与pH 5.0醋酸溶液的烧杯内。在恒温37℃磁力搅拌条件下透析，于不同时间取出定量释放液测定DOX的释放率，同时向烧杯中补充相应体积液体。利用全波长酶标仪，紫外吸收在488 nm条件下，绘制DOX标准曲线并测定PEG-DOX NPs中DOX的浓度。利用动态光散射（DLS）测定其粒径和表面电位，TEM观察形貌特征。
1.2.4细胞摄取实验取大鼠神经胶质瘤C6细胞，用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100mg/L链霉素的RM⁃PI1640培养细胞，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，2～3 d换液。取对数生长期细胞以每孔5×105个铺于12孔板内，细胞生长1 d后，向孔内加入1mL含相同DOX浓度（20mg/L）的DOX和PEG-DOX NPs，分别于孵育1.5h、4h后将孔内液体吸出，用PBS洗3次，用配制新鲜的4%多聚甲醛固定细胞10min。吸去液体并洗2次后，用5mg/L的DAPI染细胞10min，吸去液体并更新PBS，置于荧光显微镜下观察DOX和PEG-DOX NPs被细胞摄取及PEG-DOX NPs中DOX的释放行为。
1.2.5细胞增殖抑制实验取神经胶质瘤C6细胞，培养方法参考1.2.4，取对数生长期细胞以每孔5×103个铺于96孔板内，细胞生长24h后，向孔内分别加入浓度为0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/L DOX和PEG-DOX NPs。培养箱内孵育24h后，每孔加入20 μL的MTT溶液（5.0 g/L）继续培养4h，吸弃上清后每孔加入150 μL DMSO溶液，充分震荡后用酶标仪测定各孔570 nm处的吸光度（A）值。每个浓度6个平行孔，计算C6细胞的增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-样品组A平均值/对照组A平均值）×100%。
1.2.6纳米粒透过BBB实验首先制备PS80修饰PEGDOX NPs（PS80-PEG-DOX NPs），将1%（v/v）的PS-80溶液滴加至PEG-DOX NPs溶液中，涡旋震荡30min，现用现配。采用抽签法将9只BALB/c小鼠随机分为Free DOX组、PEG-DOX NPs组和PS80-PEG-DOX NPs组，各3只。每组静脉注射剂量保持其中的DOX浓度一致，均为5.0mg/kg，于注射后8h处死并解剖小鼠，取出主要脏器，包括心、肝、脾、肺、肾和脑，利用小动物活体成像系统进行组织荧光成像及荧光定量分析。
1.3统计学方法应用SPSS 19.0软件对数据进行分析，实验数据采用±s表示，2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1PEG-DOX单体的合成及纳米粒组装和表征PEG-DOX单体的合成见图1。DOX的氨基（-NH2）与PEG的醛基（-CHO）在Et3N催化条件下反应得到具有席夫碱键的聚合物PEG-DOX单体。mPEG-CHO与PEG-DOX的核磁图谱见图2，其中图2A中9.6位置的CHO峰在图2B中消失，证明醛基被反应掉，PEG-DOX单体成功合成。通过DLS 和TEM表征PEG-DOX NPs的粒径约为100 nm，见图3A，分布指数（PDI）为0.188，表面电位-5.81mV。TEM下其形貌为均一的球形，见图3B。
Fig.1 The synthesis of PEG-DOX copolymer图1 PEG-DOX单体的合成
Fig.2 1H NMR spectra ofmPEG-CHO (A) and PEG-DOX (B)图2 mPEG-CHO（A）和PEG-DOX单体（B）的1H核磁图谱
Fig.3 Hydrodynamic size distributions (A) and TEM images (B,×7 200) of PEG-DOX NPs图3 PEG-DOX NPs的粒径分布（A）和形貌（B;TEM,×7 200）
2.2药物释放PEG-DOX NPs在pH 5.0的酸性条件下48h的累积释放率约为70%，而在pH 7.4的条件下48h的累积释放率低于20%，见图4A。PEGDOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h后，TEM下其形貌呈不规则形态，说明其解体后发生聚集，见图4B。
Fig.4 Drug release profiles of PEG-DOX-Cur NPs (A) andmorphology of PEG-DOX NPs after incubation at pH 5.0 for 48h (B,×7 200)图4 PEG-DOX NPs和DOX的释放曲线（A）和PEG-DOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h的形貌（B; TEM,×7 200）
2.3细胞摄取实验孵育1.5h后，Free DOX大量被细胞所摄取并直接进入核内，而PEG-DOX NPs主要分布于细胞质中，核内基本没有DOX的荧光。在与C6细胞作用4h后，Free DOX在胞内的信号相对1.5h时明显减弱，而PEG-DOX NPs组在细胞核内的荧光信号显着增强，大量的DOX进入了细胞核，荧光强度明显强于Free DOX组，表现出较强的细胞摄取性能，同时证明PEG-DOX NPs已经在细胞内降解并释放出了DOX，见图5。
2.4细胞增殖抑制实验PEG-DOX NPs和Free DOX对C6细胞的增殖抑制均呈现浓度依赖性，即DOX浓度越高，其增殖抑制率越高，见图6。PEGDOX NPs组细胞增殖抑制率在各个浓度下均低于Free DOX组（t值分别为12.70、5.14、10.20、14.04、7.31、8.85、4.29和7.38，均P < 0.05）。
2.5纳米粒透过BBB实验Free DOX、PEG-DOX NPs和PS80-PEG-DOX NPs静脉注射8h后主要脏器的荧光成像见图7A，可见DOX的荧光信号主要分布在肝、肾和脑中；且PS80-PEG-DOX NPs组在脑中的药物荧光强度明显高于PEG-DOX NPs和Free DOX组（F=108.25，n=3，P＜0.05），见图7B，表明经PS80修饰后的PEG-DOX NPs能够更多地透过BBB。
Fig.5 Cellular uptake and localization of Free DOX and PEG-DOX NPs inhepG 2 cancer cells图5 C6细胞对Free DOX和PEG-DOX NPs在不同时间的摄取结果
1～8分别为0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/LFig.6 The cytotoxicity of Free DOX, and PEG-DOX NPs against C6 cancer cells图6 PEG-DOX NPs和Free DOX对C6细胞的增殖抑制实验
3 讨论
前药纳米粒能够有效提高疏水药物的水溶性，延长体内循环时间，其独特的纳米结构能够使其通过增强渗透滞留效应（EPR效应）来提高肿瘤组织中药物富集量，同时酸敏感的特性能够显着降低药物在正常组织中的释放，从而在保证提高抗肿瘤作用的同时降低机体不良反应[5-6]。本研究中所合成的PEG-DOX单体中的DOX具有疏水性质，而PEG具有亲水性，因此可以在水溶液中通过自组装形成前药纳米粒。PEG-DOX NPs在pH 5.0条件下的DOX释放率远远高于在pH 7.4条件下的释放率，主要是因为PEG-DOX NPs的酸敏感性能所造成的，席夫碱键在酸性条件下会发生响应性的断裂，从而导致PEG-DOX NPs的解体，进而释放药物。游离DOX为小分子，因此可以迅速透过分子质量为3.5 ku的透析袋，在短时间内几乎完全释放出来。这类pH响应性的化学键能够保证PEG-DOX NPs在pH 7.4的血液中足够稳定，DOX不能发挥药效，从而对正常组织起到保护作用；而前药纳米粒一旦进入肿瘤内，由于肿瘤组织内是酸性的微环境，可以迅速将化学键打开，释放大量DOX，从而可以提高对肿瘤组织的杀伤，提高药效[7]。
a与Free DOX组比较，b与PEG-DOX NPs组比较，P < 0.05 Fig.7 The ex vivo fluorescence images of Free DOX, PEG-DOX NPs and PS80-PEG-DOX NPs (A), and themean fluorescence intensity of brain (B)图7 Free DOX、PEG-DOX NPs及PS80-PEG-DOX NPs在小鼠体内的组织分布（A）及脑组织内单位面积平均荧光信号强度（B）
DOX对肿瘤细胞的杀伤作用主要是通过插入DNA双螺旋结构中，进而阻止肿瘤细胞的复制，因此DOX必须进入细胞核内才能发挥药效。MTT结果显示Free DOX较PEG-DOX NPs具有更高的抑制肿瘤细胞增殖的效果，与常规的载药纳米粒对细胞的增殖抑制的结果一致，这主要是由于不同的细胞摄取机制导致的[8]。DOX可以直接通过被动扩散被肿瘤细胞摄取，因此可以快速进入细胞并分布于细胞核发挥药效。前药纳米粒主要通过比较慢的胞吞作用进入细胞，进入细胞后纳米粒崩解，DOX被释放后才会发挥药效，因此体外作用时间较短，导致药效降低，但体内应用可以降低不良反应，而且纳米粒的EPR效应能够使更多的DOX进入肿瘤组织，将会产生比DOX更高的药效。
前药纳米粒系统可以依赖于受体介导的内吞机制透过BBB，并将药物递送至脑胶质瘤[9]，即通过脑内皮原生质膜上过表达的受体，包括转铁蛋白受体、胰岛素受体、内皮细胞生长因子受体和低密度脂蛋白受体等[10]。基于受体-配体特异性靶向结合的作用，可以选择相关受体的配体或一些表面活性剂修饰前药纳米粒[11]，通过受体介导的内吞机制实现前药纳米粒高效透过BBB，并通过EPR效应将药物靶向递送至脑胶质瘤。本实验体内组织分布结果证实，经过PS80修饰的前药纳米粒能够有效透过BBB，脑组织的药物浓度明显高于未修饰组，主要原因是PS80包裹PEG-DOX NPs后，在血液循环中能够高效地募集辅基质蛋白（ApoE），模拟低密度脂蛋白（LDL）粒子通过LDL受体介导的跨细胞作用有效穿透BBB[12]。同时经过PS80表面修饰后，能够有效避免P-糖蛋白（P-gp）的捕捉[13]，避免了进入脑内的药物被排出，本实验的修饰方法比受体修饰的方法更加简单有效。该系统有望成为临床治疗脑胶质瘤有效的前药纳米载体系统。
参考文献
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（2015-08-14收稿2015-09-11修回）
（本文编辑陈丽洁）
Synthesis of acid-sensitive doxorubicin prodrug nanoparticle and its application in brain glioma treatment
LIU Jinjian#, ZHANG Yumin#, YANG Cuihong, CHU Liping ,hUANG Fan, GAOhonglin, LIU Jianfeng△
Tianjin Key Laboratory of Radiationmedicine andmolecular Nuclearmedicine, Institute of Radiationmedicine, Chinese Academy ofmedical Science and Peking Unionmedical College, Tianjin 300192, China
△Corresponding Author E-mail:lewis78@163.com
Abstract:Objective To synthesize a new kind of acid-sensitive doxorubicin prodrug nanoparticles and to evaluate its anti-brain glioma effect and efficiency through blood-brain barrier (BBB).Methods The prodrug acid-sensitive poly⁃ethylene glycol (PEG) - doxorubicin (PEG-DOX) copolymer was synthesized by Schiff base reaction, and PEG-DOX pro⁃drug nanoparticles (PEG-DOX NPs) were prepared by self-assembling.The character of PEG-DOX copolymer was detected by dynamic light scattering (DLS) instrument and1H NMR.Themorphology of PEG-DOX NPs was observed by transmission electronmicroscopy (TEM).The character of drug release was detected by UVmothed.The cellular uptake efficiency of glio⁃ma cells to PEG-DOX NPs was observed by inverted fluorescencemicroscope.The anti-brain glioma effects of PEG-DOX NPs and Free DOX were studied bymTTmothed.PS80-PEG-DOX NPs were gained by themodification of PEG-DOX NPs with Tween 80.Nine BALB/cmice were separated into Free DOX, PEG-DOX NPs and PS80-PEG-DOX NPs groups by ran⁃dom drawing lots.Themean fluorescence intensity of brain andmain organs were observed by in vivo imaging system.Re⁃sults The copolymer of PEG-DOX can self-assemble into nanoparticles with the diameter of 100 nm.PEG-DOX NPs can quickly release DOX in acid environment.Although PEG-DOX NPshad slow cancer cell uptake than Free DOX, ithad lon⁃book=34,ebook=39ger accumulation.MTT results showed that PEG-DOX NPshad concentration dependent anti-brain glioma effect.Indepen⁃dent samples t-test indicated that the efficiency through BBB was significantlyhigher in PS80-PEG-DOX NPs group than that of Free DOX group and PEG-DOX NPs group.Conclusion PEG-DOX NPs show well anti-brain glioma effect in vi⁃tro, and can across BBB withhigh efficiency aftermodification, whichmake it possible for a potential therapeutic prodrug for brain glioma.
Key words:blood-brain barrier; doxorubicin prodrug; nanoparticle; brain glioma; acid-sensitive
通讯作者△E-mail: lewis78@163.com
作者简介：刘金剑（1981），男，助理研究员，主要从事自组装纳米材料、分子核医学研究
基金项目：国家自然科学基金资助项目（51203189，51303213，81171371）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目（13JCZD⁃JC28100）；“协和青年基金资助”和“中央高校基本科研业务费专项资金资助”（3332015100）；中国医学科学院放射医学研究所发展基金（1550，1428）
中图分类号：R318.08
文献标志码：A
DOI:10.11958/20150109
作者单位：中国医学科学院&北京协和医学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室（邮编300192）
