孙缦利，邓海峰，李明华，刘国良，常全忠
美满霉素对阿尔茨海默病大鼠认知损伤及海马BDNF、Bcl-2和Bax表达的影响
孙缦利，邓海峰，李明华，刘国良，常全忠△
目的观察美满霉素对阿尔茨海默病（AD）大鼠认知功能和海马脑源性神经营养因子（BDNF）、凋亡相关因子Bcl-2和Bax表达的影响，探讨美满霉素对AD大鼠脑保护作用的机制。方法侧脑室注射Aβ25-35建立AD大鼠模型。30只健康雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组和治疗组，每组10只。对照组和模型组腹腔内注射生理盐水1 mL/（kg·d），治疗组腹腔注射美满霉素50 mg/（kg·d），均持续14 d。Morris水迷宫检测行为学变化，蛋白免疫印迹（Western blotting）法和酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测海马BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表达，原位末端标记（TUNEL）法检测海马神经元凋亡率。结果美满霉素可以明显提高AD大鼠学习记忆能力，上调AD大鼠海马BDNF、Bcl-2表达，下调Bax表达，减少海马神经元凋亡。结论美满美素可以通过促进神经元的生长、抑制神经元的凋亡发挥脑保护作用。
四环素类；阿尔茨海默病；细胞凋亡；神经组织蛋白质类；认知；美满霉素；脑源性神经营养因子
阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，主要表现为渐进性记忆、认知障碍等症状［1］，随着发病率不断上升，严重威胁着人类健康和社会发展。AD的发病机制目前还不清楚，有研究报道脑源性神经营养因子（BDNF）、凋亡相关因子Bcl-2和Bax与AD的发病机制有关［2-3］。美满霉素是一种半合成的第2代四环素衍生物，容易透过血脑屏障到达中枢神经系统［4］。研究表明，美满霉素可以通过抑制星型胶质细胞的激活、神经炎症、氧化应激等途径改善痴呆大鼠的认知障碍［5-6］。然而，美满霉素是否可以通过调节BDNF、Bcl-2和Bax的表达来改善AD大鼠的认知障碍，发挥脑保护作用，目前报道甚少。本课题组拟通过观察侧脑室注射β淀粉样肽25-35（Aβ25-35）诱导的AD大鼠的认知和海马BDNF、Bcl-2和Bax的表达变化，探讨美满霉素对AD大鼠的脑保护作用机制，以期为临床治疗AD提供新思路和实验依据。
1 材料与方法
1.1材料Morris水迷宫装置（中国医学科学院药物研究所研制）；DW-5大鼠脑立体定位仪（成都泰盟科技有限公司）；美满霉素胶囊（100 mg/粒，中国惠氏制药有限公司）；青霉素（哈药集团）；BDNF、Bcl-2和Bax酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（郑州森斯科贸有限公司）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠BDNF、Bcl-2和Bax多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、Aβ25-35、戊巴比妥钠均购自Sigma公司。
1.2方法
1.2.1实验动物及分组30只健康雄性SD大鼠，清洁级，体质量（250±10）g，购自河南省实验动物中心（动物合格证编号：SCXK豫2013-0002），所有动物都在自然光暗周期的环境中饲养，自由觅食、饮水。随机数字表法分成对照组、模型组和治疗组，每组10只。
1.2.2AD模型的制备用二甲基亚砜50 μL溶解0.1 mg Aβ25-35，再用0.1 mol/L PBS 50 μL稀释成10 g/L的溶液，置于37℃温箱孵育72 h，观察其呈现明显絮状，孵育完成，4℃冰箱保存备用。实验动物常规饲养2周后，用0.8%戊巴比妥钠（10µL/g，腹腔注射）麻醉，固定于脑立体定位仪上。参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为原点，向后1.5 mm，旁开1.2 mm为穿刺点，颅钻穿孔，自颅骨表面进针3.5 mm至侧脑室，用微量注射泵将2 μL凝聚态Aβ25-35在5 min内缓慢注入，留针5 min，以使Aβ25-35充分浸润局部组织，退针后缝合伤口。对照组给予2 μL生理盐水。术后给予青霉素（4×106U/kg）肌内注射，伤口处碘伏消毒，1次/d，共5 d。术后对照组和模型组腹腔内注射生理盐水1 mL/（kg·d），治疗组腹腔注射美满霉素50 mg/（kg·d），均持续14 d，给药剂量参照文献［5］。
1.2.3行为学检测各组大鼠的学习记忆能力Morris水迷宫水池中加入适量的墨汁，使水池成为不透明色（去除视觉干扰），水温保持在22～23℃。将大鼠面向池壁放入水池，记录大鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为逃避潜伏期，历时5 d。5 d后去除平台，测其第1次到达原平台位置的时间、120 s内穿环次数。
1.2.4蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测各组大鼠海马BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表达0.8%戊巴比妥钠麻醉大鼠，经4%多聚甲醛心脏灌流，快速取出全脑，冰浴分离出大鼠前额叶皮质，按10 mL/g的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用BCA法进行蛋白定量，10%SDS-PAGE凝胶电泳，转NC膜。杂交步骤如下：10%脱脂牛奶封闭NC膜1 h，TBST（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；0.15 mmol/L NaCl；0.05%Tween 20）漂洗3次，每次10 min，然后室温下与兔抗鼠一抗BDNF（1∶500）、Bcl-2（1∶200）、Bax（1∶200）杂交反应2 h，TBST漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗IgG（1∶2 000）杂交反应1 h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10 min，加入ECL试剂反应5 min，保鲜膜包裹，暗室进行X线胶片曝光、显影和定影。然后同一张NC膜再与β-actin（1∶1 000）进行杂交反应。Western印迹条带经凝胶成像分析系统扫描处理，计算单位光密度值和条带面积，将各实验点的总光密度值与对照组比较，得到相对百分数。
1.2.5ELISA法检测各组大鼠海马BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表达0.8%戊巴比妥钠麻醉大鼠，经4%多聚甲醛心脏灌流，快速取出全脑，冰浴分离出大鼠前额叶皮质，1∶10匀浆，4℃，10 000 r/min，离心10 min，取上清液。实验严格按照说明书步骤进行。
1.2.6原位末端标记（TUNEL）法检测各组大鼠海马神经元凋亡率严格按照TUNEL检测试剂盒说明书提供的方法进行，所有切片染色均采用相同的条件，每批染色均设阴性对照。阴性对照滴加PBS代替TUNEL反应混合物孵育切片，结果为阴性。
1.3统计学方法统计学处理用SPSS 19.0软件包，实验数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1美满霉素对大鼠学习记忆能力的影响与对照组相比，模型组大鼠平均逃避潜伏期和第1次到达原平台位置的时间明显延长（P＜0.05），穿环次数明显减少（P＜0.05）；与模型组相比，治疗组大鼠平均逃避潜伏期和第1次到达原平台位置的时间明显缩短（P＜0.05），穿环次数明显增加（P＜0.05），见表1。
Tab.1Effects of minocycline on the cognition in three groups表1 美满霉素对各组大鼠学习记忆能力的影响（n=10，）
Tab.1Effects of minocycline on the cognition in three groups表1 美满霉素对各组大鼠学习记忆能力的影响（n=10，）
＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05
组别对照组模型组治疗组F逃避潜伏期（s）50.24±9.57 89.56±12.38a 57.23±10.14b 37.97＊＊第1次到达原平台位置的时间（s）7.54±1.98 16.63±4.19a 9.58±2.70b 23.72＊＊穿环次数6.52±1.04 2.61±0.85a 5.25±1.36b 32.67＊＊
Tab.2Expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of three groups表2 各组大鼠海马BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表达（n=10，ng/L，）
Tab.2Expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of three groups表2 各组大鼠海马BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表达（n=10，ng/L，）
＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05
组别对照组模型组治疗组F Bax 28.62±5.29 87.35±11.53a 49.13±9.62b 105.15＊＊BDNF 38.60±6.46 12.14±3.28a 24.07±4.59b 71.62＊＊Bcl-2 34.27±6.53 13.60±3.42a 21.32±4.16b 45.68＊＊
2.2美满霉素对各组大鼠海马BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
2.2.1Western blotting法检测结果模型组大鼠海马BDNF和Bcl-2蛋白表达量低于对照组（P＜0.05），而Bax蛋白表达量显着高于对照组（P＜0.05）。与模型组相比，治疗组大鼠海马BDNF和Bcl-2蛋白表达量均显着上调（P＜0.05），而Bax蛋白表达量显着下调（P＜0.05），见图1。
2.2.2ELISA法检测结果与对照组相比，模型组大鼠海马BDNF和Bcl-2蛋白表达显着降低（P＜0.05），而Bax蛋白表达显着增加（P＜0.05）；与模型组相比，治疗组大鼠海马BDNF和Bcl-2蛋白表达均显着升高（P＜0.05），而Bax蛋白表达显着下降（P＜0.05），见表2。
2.3美满霉素对各组大鼠海马神经元凋亡的影响TUNEL法检测结果显示，3组间海马神经元凋亡率差异有统计学意义（F=106.22，P＜0.01）。与对照组（6.47±3.28）%相比，模型组大鼠海马神经元凋亡率（43.26±7.73）%显着增高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组海马神经元凋亡率（22.68±5.05）%明显减少，但高于对照组（P＜0.05）。
3 讨论
AD的主要病理特征是神经元的丢失，而细胞凋亡在AD患者神经元的丢失中扮演重要角色，与AD的发生、发展关系密切，而且在大脑皮质和海马区的神经元丢失更加明显［7-8］。AD神经元凋亡机制复杂，目前尚无定论。因此，进一步研究AD神经元凋亡机制并采取一定的措施干预神经元的凋亡可以为防治AD提供一定的帮助。Bcl-2家族蛋白是所有细胞凋亡通路中的下游蛋白，Bcl-2家族成员包括Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Bad等［9］，当Bcl-2表达增加可抑制凋亡，而Bax表达增加可促进凋亡，Bcl-2/Bax比值通常被认为是反映细胞是否凋亡的重要指标［10］。BDNF是神经生长因子的家族成员之一，在中枢和外周均广泛存在，对神经元的存活、再生、修复和诱导分化具有重要作用［11-13］。因其主要在海马和皮质表达，而海马涉及了学习和记忆、执行、注意等认知功能［14］，这提示BDNF可能与认知功能有关。
基于以上研究和假设，本课题组通过侧脑室注射Aβ25-35建立AD大鼠模型，采用行为学结合分子生物学的手段，观察美满霉素对AD大鼠海马区BDNF、Bcl-2和Bax表达的影响。实验结果发现，美满霉素可以明显改善AD大鼠的认知能力，上调AD大鼠海马BDNF、Bcl-2的表达，下调Bax的表达，降低神经元凋亡率，提示美满霉素可能通过促进神经元的生长、抑制神经元的凋亡，改善AD的认知功能，发挥脑保护作用。
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（2016-01-22收稿2016-05-22修回）
（本文编辑魏杰）
Effects of minocycline on the cognition and expression of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of Alzheimer's disease model rats
SUN Manli，DENG Haifeng，LI Minghua，LIU Guoliang，CHANG Quanzhong△
School of Basic Medical Sciences，Luohe Medical College，Luohe 462000，China△
E-mail：cqzchang@tom.com
ObjectiveTo investigate the effect of minocycline on the cognition and expressions of brain-derived neurotrophic factor（BDNF），apoptosis related factor Bcl-2 and Bax in hippocampus of rats with Alzheimer's disease（AD）.MethodsThe rat model was established by microinjection of Aβ25-35into lateral ventricle.Thirty healthy male SD rats were randomly divided into three groups:control group，model group and minocycline treatment group.Normal saline 1 mL/（kg·d）was intraperitoneally injected in control group and model group.The minocycline treatment group was intraperitoneally injected with minocycline 50 mg/（kg·d）for 14 days.Morris water maze was used to detect the behaviors of animals.The expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus were measured by Western blotting and enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The apoptosis of neurons was detected by TdT-mediated dUTP nick-end labeling（TUNEL）.Results Minocycline greatly improved the behaviors of AD rats，up-regulated the expressions of BDNF and Bcl-2，and downregulated the expression of Bax in hippocampus，and reduced cell apoptosis.ConclusionMinocycline plays a protective role in neural function by promoting the growth of neurons and inhibiting the neuronal apoptosis.
Tetracyclines；Alzheimer disease；apoptosis；nerve tissue proteins；cognition；Minocycline；brain-derived neurotrophic factor
R741
A
10.11958/20160028
漯河医学高等专科学校2015年度基础科学重点研究项目（2015-S-LMC06）；2015年度河南省科技厅基础与前沿技术研究（152300410014）；2014年度河南省科技厅自然科学项目资助（142300410431）
漯河医学高等专科学校基础医学部（邮编462000）
孙缦利（1987），女，讲师，硕士，主要从事脑认知功能的研究
E-mail:cqzchang@tom.com
