血清白细胞介素-35水平与急性运动轴索型神经病患者疾病严重程度的关系

朱思语，常生辉，丑丽莎，张大启，李立敏，杨丽

急性运动轴索型神经病（acute motor axonal neuropathy，AMAN）是吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）的常见亚型，好发于东亚和南美洲人群，临床特点是病情急，易迅速出现四肢瘫痪和呼吸肌麻痹，进展快、病残率高、预后差。目前，研究多认为AMAN是一种继发于感染后的自身免疫性疾病［1］。白细胞介素-35（interleukin-35，IL-35）是一种由活化的炎症细胞分泌的负向免疫调节因子，目前其已知的功能包括：维持外周的免疫系统、调控效应T细胞的增殖及抑制Th17细胞的分化和IL-17的合成；其与自身免疫性疾病和感染性疾病密切相关。研究表明，IL-35在自身免疫性疾病的发病机制中起重要作用［2-4］。然而，在AMAN患者中IL-35的作用尚未明确。本研究旨在探讨IL-35与AMAN患者疾病严重程度、预后及其他相关临床参数之间的关系，以期为临床提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2010年7月—2015年7月于天津医科大学总医院神经内科住院治疗的AMAN患者30例（AMAN组），男15例，女15例，年龄17～75岁，平均（44.43±15.73）岁；均符合1990年Asbury制定的GBS诊断标准中AMAN亚型［5］，且排除高钾血症、低钾血症、血卟啉病、结缔组织病和其他神经系统疾病。同期选取健康对照组（healthy controls，HCs）30例，男8例，女22例，年龄23～65岁，平均（47.63±12.10）岁，均为我院体检中心选取的健康志愿者，抽血前无感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等病史。2组年龄（t=0.883）与性别（χ2=3.455）差异无统计学意义（P＞0.05）。2组血标本收集前患者未接受过皮质类固醇激素、抗炎药物、血浆交换和免疫球蛋白治疗。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 记录所有研究对象性别、年龄及患者既往感染史、血清抗神经节苷脂GM1/GQ1b抗体、住院期间治疗情况等资料。研究对象均自发病起约2周时进行神经电生理检查。入院2周时采用GBS运动功能缺损评分（GBS disability score，GDS）评估患者的疾病严重程度［6］，采用Erasmus吉兰-巴雷综合征预后评分（Erasmus GBS outcome score，EGOS）评估患者6个月内的预后［6-7］，其中GDS和EGOS评分由两位具备资格的神经科医生独立完成并校对。

1.2.2 血清IL-35水平检测 AMAN组于急性期采集空腹静脉血3 mL，对照组空腹采等量血标本。留取血清标本于-80℃冻存，采用人IL-35酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（美国Biolegend公司）检测血清IL-35水平，参照说明书要求应用酶标仪测定在450 nm波长下各底物吸光度值，制作标准曲线，计算各样本IL-35浓度，本实验中依标准品对IL-35检测限度（0.13 μg/L）分为低分泌组（＜0.13 μg/L）和分泌组（≥0.13 μg/L）组，比较2组GDS和EGOS水平差异。

1.2.3 血清抗神经节苷脂GM1和GQ1b抗体检测 将冻存于-80℃的血清标本分别采用GM1和GQ1b的ELISA试剂盒（中国武汉华美CUSABIO）进行检测，根据说明书用酶标仪在450 nm波长下测定光密度（OD）值，与临界值相比较。阳性判断：样本孔OD/阴性对照孔OD≥2.1，阴性判断：样本孔OD/阴性对照孔OD＜2.1。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计数资料采用例（%）表示，组间比较用χ2检验；符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较用Mann-Whitney秩和检验，相关分析采用Spearman等级相关。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1AMAN组一般资料结果 AMAN组有前驱感染史12例，其中腹泻8例，上呼吸道感染4例。GDS（3.90±0.80）分，EGOS（4.53±1.07）分；GM1抗体阳性13例，GQ1b抗体阳性2例，双抗体阳性患者1例。

2.2 2组血清IL-35水平比较 AMAN组（30例中有17例IL-35的值为0）及HCs组血清IL-35水平分别为0（0，0.73）μg/L、0.52（0.24，2.42）μg/L，差异有统计学意义（Z=2.797，P＜0.05）。

2.3 血清IL-35水平与疾病严重程度及预后的关系 AMAN患者急性期血清IL-35水平与住院2周GDS和EGOS呈负相关（rs分别为-0.430和-0.523，均P＜0.05）。

2.4 低分泌组和高分泌组GDS和EGOS情况 低分泌组（17例）患者的GDS和EGOS均高于分泌组（13例），差异有统计学意义（GDS：分，4.18±0.81vs.3.54±0.66，t=2.312，P＜0.05；EGOS：分，4.97±1.04vs.3.96±0.83，t=2.872，P＜0.05）。

3 讨论

目前研究表明，AMAN的发病机制与抗神经节苷脂抗体及补体介导的对轴突表面细胞膜的攻击有关，免疫攻击的对象主要是运动神经轴膜上的神经节苷脂 GM1，GM1b，GD1a和 GalNAc-GD1a［8-9］；而IL-12家族在炎症的发病过程中起重要作用，是中枢神经系统自身免疫性疾病的潜在治疗靶点［10］。作为IL-12家族的成员，IL-12和IL-23在GBS患者中的促炎作用已经被证实［11-12］，而IL-35的作用还未完全阐明。IL-35作为一种抗炎因子，由调节性T细胞（Tregs）和调节性B细胞（Bregs）产生，其通过抑制Th1/Th17细胞来下调免疫反应，在维持免疫稳态中具有重要作用，并且在葡萄膜炎动物模型中已经被证实，IL-35能抑制有害的免疫反应，将重组IL-35转移到小鼠体内后发现，Bregs诱导产生的IL-35能阻止葡萄膜炎的进展，这提示IL-35为治疗自身免疫性疾病提供了一种可能［13］，也被认为是一个很有前景的免疫治疗靶点［10］。本研究发现，AMAN组较HCs组IL-35水平偏低，表明IL-35可能参与了AMAN的病理改变，除此之外，AMAN组血清IL-35水平与患者疾病的严重程度和预后呈负相关，提示IL-35可能在AMAN患者中起到保护作用。低分泌组GDS和EGOS较分泌组升高，表明低分泌组患者的病情及预后均较重，提示IL-35有希望成为AMAN患者治疗的靶点，这为AMAN患者早期病情的评估、预后及对应治疗均有重要的指导意义。

目前，相关研究认为IL-35是一种负向免疫调节因子，主要抑制CD4+效应T细胞（Teff细胞、Th1、Th2、Th17）和B细胞的增殖、降低Th1型细胞因子的分泌，以及通过抑制调节性T细胞的转录因子Foxp3的表达使IL-35诱导Tregs产生（iTR35细胞）作用，最终维持机体的免疫稳态［12，14-15］。此外，IL-35是调节CD4+T细胞功能及Tregs活性的治疗靶点，目前已经证实，GBS患者中IL-35在体外治疗CD4+T细胞的疗效是通过降低Tregs、Th2细胞的反应来增强Th1和Th17细胞的应答而实现［16］。

综上所述，IL-35可能参与了AMAN的发病机制，且在疾病的发展过程中起保护作用。血清IL-35的水平可能作为评估患者病情严重程度和预后的重要生物学标志物，也有希望成为这一疾病新的治疗靶点。

［1］张静，郭力.吉兰-巴雷综合征发病机制研究进展［J］.中国现代神经疾病杂志，2012，12（2）：117-121.Zhang J，Guo L.Progress in the pathogenesis of Guillain-Barre syndrome［J］.Chin J Contemp Neurol Neurosurg，2012，12（2）：117-121.doi：10.3969/j.issn.1672-6731.2012.02.004.

［2］杨景英，陈学利，吴文钦，等.白细胞介素-12家族与感染性疾病相关研究进展［J］.临床检验杂志，2014，32（6）：443-446.Yang JY，Chen XL，Wu WQ，et al.Research of progress in interleukin-12 family with infectious diseases［J］.Chin J Clin Lab Sci，2014,32（6）：443-446.doi：10.13602/j.cnki.jcls.2014.06.12.

［3］Choi J，Leung PS，Bowlus C，et al.IL-35 and Autoimmunity：a comprehensive perspective［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2015，49（3）：327-332.doi：10.1007/s12016-015-8468-9.

［4］Cao J，Xu F，Lin S，et al.IL-35 is elevated in clinical and experimental sepsis and mediates inflammation［J］.Clin Immunol，2015，161（2）：89-95.doi：10.1016/j.clim.2015.08.016.

［5］Asbury AK，Cornblath DR.Assessment of current diagnostic criteria for Guillain-Barre syndrome［J］.Ann Neurol，1990，27（Suppl）：S21-S24.

［6］Hughes RA，Newsom-Davis JM，Perkin GD，et al.Controlled trial prednisolone in acute polyneuropathy［J］.Lancet，1978，2（8093）：750-753.

［7］van Koningsveld R，Steyerberg EW，Hughes RA，et al.A clinical prognostic scoring system for Guillain-Barre syndrome［J］.Lancet Neurol，2007，6（7）：589-594.

［8］van den Berg B，Walgaard C，Drenthen J，et al.Guillain-Barre syndrome：pathogenesis，diagnosis，treatment and prognosis［J］.Nat Rev Neurol，2014，10（8）：469-482.doi：10.1038/nrneurol.2014.121.

［9］Nyati KK，Prasad KN.Role of cytokines and Toll-like receptors in the immunepathogenesis of Guillain-Barre syndrome［J］.Mediators Inflamm，2014，2014：758639.doi：10.1155/2014/758639.

［10］Sun L，He C，Nair L，et al.Interleukin 12（IL-12）family cytokines：role in immune pathogenesis and treatment of CNS autoimmune disease［J］.Cytokine，2015，75：249-255.doi：10.1016/j.cyto.2015.01.030.

［11］Shen P，Fillatreau S.Suppressive functions of B cells in infectious diseases［J］.Int Immunol，2015，27（10）：513-519.doi：10.1093/intimm/dxv037.

［12］Zongyi Y，Funian Z，Hao L，et al.Interleukin-35 mitigates the function of murine transplanted islet cells via regulation of Treg/Th17 ratio［J］.PLoS One，2017，12（12）：e0189617.doi：10.1371/journal.pone.0189617.

［13］Han J，Sun L，Fan X，et al.Role of regulatory b cells in neuroimmunologic disorders［J］.J Neurosci Res，2016，94（8）：693-701.doi：10.1002/jnr.23749.

［14］Huang A，Cheng L，He M，et al.Interleukin-35 on B cell and T cell induction and regulation［J］.J Inflamm（Lond），2017，14：16.doi：10.1186/s 12950-017-0164-5.

［15］Wang RX，Yu CR，Dambuza IM，et al.Interleukin-35 induces regulatory B cells that suppress autoimmune disease［J］.Nat Med，2014，20（6）：633-641.doi：10.1038/nm.3554.

［16］Liuh，Zhang W，Tian FF，et al.IL-35 is involved in the pathogenesis of Guillain-Barre syndrome through its influence on the function of CD4+T cells［J］.Immunol Invest，2015，44（6）：566-577.