明建松 ，王晓雪 ，袁玉华△
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）为糖尿病并发症的一种，其也是引发终末期肾脏病（ESRD）的病因之一，且本病的发病率逐年上升，大约有40%的DN患者最终会发展成ESRD［1-2］。目前，DN的发病机制尚未明了，既往的研究认为其可能与肾血流动力学改变、遗传、炎症、糖脂代谢紊乱以及氧化应激等机制有关［3-4］。目前，对于DN，除控制血压、血糖等对症支持治疗外，尚无治疗本病的特效药物，很多患者在进入ESRD后，只能通过肾移植或终身透析来延续生命，大大增加了患者家庭与社会的负担，同时患者还需承担巨大的精神压力。因此，对于DN的防治具有显着的社会意义。
在DN的发生过程中，氧化应激现已被认为是一重要因素，机体氧化应激的水平上升可促使炎性因子的分泌，反过来，释放的炎性因子又会对氧化应激的水平产生影响，进而会加重本病［5-6］。近年来相关研究表明，Nrf-2/ARE通路在机体发生抗氧化应激时发挥重要作用，若对体内转录因子NF-E2相关因子2（Nrf-2）的表达进行适当的干预，就可阻断氧化应激相关通路，阻止相关疾病的进展［7］。丹参属于传统中药唇形科鼠尾草属，其有除烦安神、祛瘀止痛、凉血消痈及活血等的功用［8］。丹酚酸B则是丹参提取物中的一种，具有调血脂、抗氧化、抗肝纤维化、改善肾功能及抗炎等的功用［9-12］。当前，丹酚酸B对糖尿病血管病变进行的相关研究主要是抑制内皮细胞的凋亡及调节血脂等方面，但其对抗氧化应激方面的研究鲜有报道［13］。因此，笔者建立大鼠DN模型，观察不同剂量的丹酚酸B灌胃后，大鼠肾组织中Nrf-2和血红素加氧酶1（HO-1）表达的变化，探讨丹酚酸B对DN的抗氧化应激作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性SD大鼠40只，8周龄，无特定病原体（SPF）级，体质量（200±10）g，由武汉华联科生物公司（批号：2005416）提供，动物于天津医科大学总医院采用标准饲料喂养，自由饮水、饮食，适应性饲养7 d后进行实验。本研究经天津医科大学动物护理与使用委员会批准。
1.2 主要药品及试剂 丹酚酸B购于西安森冉有限公司（1 kg/盒，批号：2002351）；链脲佐菌素（STZ，纯度99.9%）购于西安热默尔生物公司（1 g/瓶，批号：18883664），使用0.1 mmol/L的枸橼酸钠缓冲液（pH=4.2）配制STZ工作液（配制后30 min内使用完）；实验检测相关血液指标（24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、总胆固醇及三酰甘油）的试剂盒及相关抗体购于艾美捷科技有限公司；实验所用PCR相关试剂盒购于南京一道科技有限公司。
1.3 实验分组与模型构建 按照随机数字表法将40只大鼠随机分为对照组、模型组、丹酚酸B组低及高剂量组，每组10只。模型制备：使用大鼠尾静脉注射STZ（40 mg/kg）并高糖高脂的食物喂养以构建DN模型，对照组使用相同剂量枸橼酸钠缓冲液进行尾静脉注射且为正常饮食，每日注射1次，连续1周。72 h取大鼠尾静脉血以检测血糖，当随机血糖＞16.7 mmol/L或空腹血糖＞7.0 mmol/L，即为糖尿病模型构建成功；1周后，检测大鼠24 h尿蛋白，当浓度＞20 mg/24 h，即为DN模型构建成功。药物处理：丹酚酸B低、高剂量组大鼠于造模成功后分别给予丹酚酸B 10 mg/kg、20 mg/kg灌胃，每日1次，连续6周；对照组及模型组给予等体积橄榄油灌胃。
1.4 标本收集 分组处理6周后，收集大鼠24 h尿液，检测24 h尿蛋白，之后采用戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，采集眼球血与肾组织，分离眼球血血清用以检测血糖、血肌酐、总胆固醇及三酰甘油的含量；肾组织洗净后分为2份，1份在液氮中速冻后，置于-70℃保存，1份置于4%多聚甲醛中固定，常规制备石蜡切片。
1.5 生化指标检测 取大鼠24 h尿液及血清，分别检测24 h尿蛋白及血糖、血肌酐、总胆固醇及三酰甘油的含量，操作严格按照试剂盒说明书。
1.6 蛋白免疫印迹（Western blot，WB）法检测Nrf-2、HO-1蛋白表达水平 大鼠冷冻肾组织在液氮中研磨，加入1.5 mL蛋白裂解液，采用蛋白抽提试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白总量。SDS-PAGE凝胶电泳后，半干法将目的蛋白转印至PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭1 h；分别加入鼠抗Nrf-2（1∶500）、HO-1（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）的多克隆抗体，4 ℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。采用Image-Pro Plus 6.0来检测相关蛋白的灰度值，相对灰度值=相关蛋白的灰度值/内参GAPDH灰度值。
1.7 逆转录PCR（RT-PCR）法检测肾组织中Nrf-2、HO-1 mRNA表达水平 大鼠冷冻肾组织在液氮中研磨、打碎后-70℃过夜保存，隔日解冻静置10 min，依次下列操作，加入100 μL氯仿、静置离心、250 μL异丙醇、静置离心弃上清、750 μL乙醇、离心弃上清吹干，加入无酶水混匀后检测mRNA浓度。mRNA逆转录成cDNA后（反应条件：42℃30 min；85 ℃ 5 min）进行PCR。引物：Nrf-2上游5′-GTGCCCT‑GTGCAGTTGTG-3′，下游 5′-GATAGGTCGGCGGTTCAT-3′；HO-1 上游 5′-CAGCCACCAACAGTCATCAT-3′，下游 5′-ACTCATCGCTCATCCTTCG-3′；内参 GADPH 上游 5′-CTG‑GTGTTCGGCTTTCTC-3′，下 游 5′-TTGTGGTCCATCT‑CATCG-3′。反应条件：94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30个循环；72℃5 min。采用Image-Pro Plus 6.0检测目的基因mRNA的灰度值并计算相对表达量（目的基因的灰度值/内参GAPDH灰度值）。
1.8 PAS染色观察肾组织病理形态变化 大鼠肾组织切片进行烘片与脱蜡后。按照PAS法染色程序对切片逐步进行染色，封片后置于光学显微镜下，观察肾组织发生病理改变的程度。
1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组生化指标比较 与对照组比较，模型组24 h尿蛋白、血清中血糖、血肌酐、总胆固醇及三酰甘油水平显着升高；与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组上述指标均明显下降，且呈剂量依赖性。见表1。
2.2 各组肾组织中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA的表达情况比较 与对照组比较，模型组大鼠肾组织中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA表达水平显着升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组大鼠肾组织中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA表达水平显着升高，且呈剂量依赖性。见图1、2，表2、3。
2.3 各组PAS染色结果的比较 对照组SD大鼠肾组织未见到异常的病理改变，肾小球毛细血管正常，基膜未见增厚等现象；与对照组比较，模型组大部分视野可见到肾小球毛细血管呈现弥漫性的增厚，肾小球变肥大及基底膜出现增厚；与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组大鼠肾组织病理损伤程度均减轻，且呈现出剂量依赖的趋势。见图3。
Fig.1 Comparison of relative expression levels of related proteins between five groups图1 各组相关蛋白相对表达量的比较
Tab.2 Comparison of relative expression levels of Nrf-2 and HO-1 proteins between five groups表2 各组相关蛋白相对表达量的比较 （±s）
Tab.2 Comparison of relative expression levels of Nrf-2 and HO-1 proteins between five groups表2 各组相关蛋白相对表达量的比较 （±s）
组别对照组模型组t n 10 10 Nrf-2/GAPDH 0.215±0.039 0.453±0.029 15.451＊HO-1/GAPDH 0.314±0.008 0.438±0.043 8.732＊组别模型组低剂量组高剂量组F n 10 10 10 Nrf-2/GAPDH 0.453±0.029 0.635±0.057a 0.863±0.037ab 229.356＊HO-1/GAPDH 0.438±0.043 0.599±0.051a 0.791±0.046ab 138.667＊
3 讨论
随着人类各种生活习惯的变化及人口的老年化，糖尿病的发病率正在逐年的上升，早在2010年相关调查结果表明，我国糖尿病的发生率已位居全球第一［14］。DN属于糖尿病中最常见的一种并发症，其早期以肾小球的肥大、肾小管与肾小球基底膜的增厚以及基质的聚积等病变为主，后期则会发生肾小管间质或者肾小球的纤维化病变，最为严重的即是导致ESRD［15］。
Tab.1 Comparison of 24-h urine protein,blood glucose,serum creatinine,total cholesterol and triglycerides between five groups表1 各组24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、总胆固醇及三酰甘油的比较 （n=10，x±s）
Fig.2 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between four groups图2 各组相关mRNA相对表达量的比较
Tab.3 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between five groups表3 各组相关mRNA相对表达量的比较 （n=10,±s）
Tab.3 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between five groups表3 各组相关mRNA相对表达量的比较 （n=10,±s）
组别对照组模型组t模型组低剂量组高剂量组F Nrf-2/GAPDH 0.307±0.026 0.501±0.040 12.539＊0.501±0.040 0.710±0.032a 0.881±0.040ab 250.277＊HO-1/GAPDH 0.273±0.017 0.416±0.040 10.379＊0.416±0.040 0.628±0.059a 0.751±0.035ab 133.318＊
Fig.3 Comparison of PAS staining results between four groups(×40)图3 各组PAS染色结果的比较（×40）
丹参有除烦安神、祛瘀止痛、凉血消痈及活血等功用，对免疫系统、呼吸系统以及心脑血管等都可起到一定保护的作用，已在临床心绞痛、失眠、肝脾肿大及痛经等各种疾病得以应用［16-17］。丹酚酸B为丹参中水溶性的成分且有活性，能够起到调血脂、抗氧化、抗肝纤维化、改善肾功能及抗炎等的功用，但其在对抗氧化应激方面鲜有研究。
在人体中氧化应激实为一种防御功能，其与机体发生的衰老以及某些疾病等之间存在一定关联，如糖尿病、缺血再灌注损害以及认知缺失所导致的Alzheimer病等［18］。氧化应激现已被认为是引发糖尿病及其出现相关并发症的发病机制之一［19］。Nrf-2是机体进行抗氧化应答系统中最重要的转录因子，其是亮氨酸拉链转录激活因子家族（即为CNC）成员中的一个，在正常的状态之下，其可在细胞质中与Keap1发生结合，而此时的Nrf-2处于无活性的状态，且处于极易发生降解的状态；如若机体受到了外界的一些刺激，机体氧化应激被激活，此时Nrf-2会与Keap1发生解离，进而处于活化的状态，其发生活化后随即进入到细胞核中，以调节其下游的相关因子，从而抑制氧化应激反应，来抵抗外界的刺激［20］。HO-1属于Nrf-2下游的相关因子之一，其有抗炎与抗氧化的双重功用，现已被证明在高血压、急性肺损伤、败血症以及肾损伤等疾病中有一定的保护能力。本实验的结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中Nrf-2、HO-1的蛋白及mRNA表达量显着升高；与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组大鼠肾组织中Nrf-2、HO-1的蛋白及mRNA表达量显着升高，且呈剂量依赖性，表明丹酚酸B可上调Nrf-2、HO-1的表达量以对DN大鼠起保护功用，这与24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、总胆固醇与三酰甘油含量以及PAS染色的结果是相符的。
综上所述，丹酚酸B对DN大鼠有改善的功用，其可能作用的机制与上调肾组织中Nrf-2及HO-1的表达存在一定的关联，且其保护功用呈现为剂量依赖的趋势。但本研究尚不足以证明丹酚酸B在氧化应激中的具体作用形式，还需为此进行相关的研究以进一步的了解其机制。除此之外，丹酚酸B可否通过其他的途径而对肾脏起到保护作用，还需深入研究。
