TNF-α调控HODs样细胞瞬时感受器电位TRVP2通道蛋白表达的初步研究

阙克华，王瑜，刘洁，刘杨秋，文静

人成牙本质细胞（human odontoblasts，HODs）是牙髓组织中十分特殊且生物学功能复杂多样的细胞，在牙髓防御外界伤害性刺激和组织修复中发挥重要作用。近年来研究发现，HODs是潜在的感知外部刺激和牙髓微循环中瞬态变化的重要细胞之一［1］。瞬时感受器电位（transient receptor potential，TRP）通道蛋白在人体感受外界各种刺激，包括温度、酸、渗透压和机械刺激等方面发挥重要作用。瞬时感受器电位香草酸受体2（transient receptor potential vanilloid 2，TRPV2）离子通道是TRP亚家族成员之一，在组织中分布广泛，参与机体感受温度、渗透压和机械刺激等多种生理功能［2］。课题组前期实验已经证实TRPV2 在牙髓组织细胞中的表达［3］。但目前对TRPV2 离子通道在人牙髓组织中炎症相关的作用机制研究尚较缺乏，特别是炎症因子对HODs样细胞TRPV2影响的研究少见报道。有研究报道肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）在早期牙髓炎症发展过程中较其他炎症因子具有更高的检出率。因此，本研究通过观察TNF-α 调控 HODs 样细胞 TRPV2 离子通道表达水平，进一步探讨TRPV2 离子通道在牙髓组织中的机制及生理功能。

1 材料与方法

1.1 样本选择 收集2016年9月—2017年1月在天津医科大学口腔医院口腔颌面外科门诊因阻生、正畸等原因而预防性拔除的健康完整第三磨牙共20 颗。患者年龄18～25 岁，无全身系统性疾病，牙髓组织健康，无龋坏、牙周炎和牙髓炎表现。所有实验用牙齿经过患者知情同意，本研究通过了天津医科大学口腔医院伦理委员会审查（批准号TMUSHh-MEC2014010）。

1.2 主要材料及仪器 小鼠抗人涎磷蛋白（DSPP）单克隆抗体、兔抗人nestin 多克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司；兔抗人TRPV2抗体购自美国Pro Sci公司；胎牛血清购自中国四季青公司；β-甘油磷酸钠、M-MLV 逆转录酶、高速离心机均购自美国Sigma 公司；TNF-α 购自美国 Novus Bio；肿瘤坏死因子受体1（TNF receptors 1，TNFR1）拮抗剂R-7050 购自英国 Tocris Bioscience 公司；细胞固定/破膜试剂盒、PCR 电泳仪、FACSCanto Ⅱ均购自美国BD公司；Olympus DP72型光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 HODs 样细胞的培养与鉴定 无菌条件下劈开牙齿，取出牙髓，剪刀去除根尖端约2 mm部分，用含双抗的PBS漂洗3 遍。湿润条件下将牙髓剪碎至0.5～1.0 mm3。加入1.5 mL 培养基，吹打均匀后接种到T25 培养瓶中，培养基为含10%的胎牛血清、2 mmol/L β-甘油磷酸钠、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素和0.25 g/L两性霉素B的DMEM培养基，置入37 ℃5%CO2恒温培养箱中孵育，2～4 d 进行换液。在细胞显微镜下观察，直至组织周围有呈现成纤维细胞样形态的细胞爬出。待细胞长满后进行传代，选取第4～6代细胞进行实验。将细胞接种于60 mm平皿中，用含10%胎牛血清、50 g/L 维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM 矿化液培养。待出现细胞结节后进行von Kossa 染色。另取细胞制成单细胞悬液，接种至12孔板，放置培养箱培养，PBS 洗涤3 次，4%多聚甲醛室温固定15 min。对细胞进行DSPP 和nestin 免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色，一抗使用小鼠多克隆抗体DSPP（DSPP∶PBS=1∶200）和nestin（nestin∶PBS=1∶200），二抗使用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗小鼠 IgG（FITC∶PBS=1∶200～1∶400）。阴性对照组使用PBS 替代一抗，其余条件一致。使用Olympus DP72型光学显微镜及照相系统进行拍照，传代及诱导通过免疫荧光鉴定成为HODs 样细胞后冻存，后续实验随用随取。

1.3.2 IF 染色检测TRPV2 在HODs 样细胞中的表达 将细胞接种到载玻片上，室温下在4%多聚甲醛中固定15 min。用1%Triton X-100 渗透5 min 后，用10%山羊血清在37 ℃封闭非特异性结合位点2 h。将载玻片滴加一抗兔多克隆抗体TRPV2（稀释度1∶200），4 ℃下孵育过夜。洗净后，滴加二抗（山羊多克隆抗鼠IgG-FITC）37 ℃下孵育30 min。细胞核用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚在室温下复染8 min，用抗荧光衰减封片剂滴在载玻片上封片，然后通过直立荧光显微镜观察。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测TNF-α对TRPV2 离子通道mRNA 表达的影响 将细胞分别在含有0、1、10 μg/L TNF-α的培养基中培养24 h后，按照Trizol试剂使用说明，从细胞中提取总RNA。使用M-MLV 逆转录酶将纯化的总RNA 逆转录成cDNA。在ABI-7500 实时PCR 仪中进行实时定量 PCR 扩增，反应条件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40个循环。选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为管家基因使相对表达水平标准化。使用Opticon Monitor Analysis Software V 2.02（MJ Research）进行分析。TRPV2 引物：上游5'-TAGAGAATGGAGCGAATGTT-3'，下游 5'-TCATACATGTGGATCACCAG-3'，产物大小327 bp。GAPDH 引物：上游5'-GGAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，产物大小226 bp。另取细胞进行TNFR1拮抗剂 R-7050 的相关实验，在10 μg/L TNF-α 处理 24 h 前，用 5 μmol/L R-7050 处理细胞 2 h，阴性对照组无 R-7050 处理，再用上述方法进行检测，每组实验重复3次。

1.3.4 蛋白质印迹法（Western Blot，WB）分析 TNF-α 对TRPV2 离子通道蛋白表达的影响 将细胞分别在含有0、1和 10 μg/L TNF-α 的培养基中培养 24 h 后，预冷 PBS 冲洗细胞，洗净液体后加入含苯甲基磺酰氟的RIPA 裂解液（RIPA=1∶100，现配现用），加入量为细胞体积的4 倍，使细胞裂解。二喹啉甲酸测定法测定总蛋白质浓度。通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后依次用相应的一抗和二抗，并用电化学发光免疫（ECL）系统成像。另取细胞进行R-7050 的相关实验，在10 μg/L TNF-α 处理24 h 前，用 5 μmol/L R-7050 处理细胞2 h，阴性对照组无R-7050处理，再用上述方法进行检测，每组实验重复3次。

1.3.5 流式细胞术（FCM）检测TNF-α 对TRPV2离子通道表达的影响 将细胞分别在含有0和10 μg/L TNF-α的培养基中培养24 h 后，按照细胞固定/破膜试剂盒说明配制反应体系并设置反应条件。将细胞悬浮液置于Cytofix/Cytoperm 溶液中，于4 ℃孵育20 min，滴加TRPV2 抗体（稀释度1∶200），4 ℃孵育2 h，滴加 Alexa Fluor 488 标记的针对兔 IgG 的山羊多克隆抗体，使用FACS Canto Ⅱ进行检测，通过FlowJo 程序分析数据。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件对结果数据进行统计学分析。符合正态分布计量资料采用均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组间多重比较采用Dunnett-t法。检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 HODs 样细胞的鉴定 经矿化液培养诱导后，肉眼可见白色点状物，倒置显微镜下细胞呈复层生长，有白色团块，von Kossa 染色显示其中央区为深褐色，见图1。通过免疫荧光染色确定DSPP 与nestin 呈阳性表达，且主要位于细胞核和细胞浆，见图2。确定本实验分离培养的细胞为HODs样细胞。

Fig.1 The expression of HODs-like cells induced by mineralization solution图1 HODs样细胞经矿化液诱导后的表现

Fig.2 The expression of immunofluorescent of cellular DSPP and nestin(×200)图2 细胞DSPP和nestin免疫荧光染色结果（×200）

2.2 TRPV2离子通道在HODs样细胞中的表达 免疫荧光染色结果显示，TRPV2 离子通道几乎在所有细胞呈阳性表达，主要表达于细胞核、细胞浆和细胞膜上，见图3。

Fig.3 Results of the expression levels of TRPV2 ion channel in HODs-like cells observed by optical microscope(IF staining,×400)图3 光学显微镜下观察TRPV2离子通道在HODs样细胞中的表达（免疫荧光染色，×400）

2.3 TNF-α 影响TRPV2 离子通道表达水平 RT-qPCR 和 WB 检测结果显示，与对照组相比，1 μg/L TNF-α 对 TRPV2 通道的 mRNA 和蛋白质表达无明显影响（P＞0.05），而10 μg/L TNF-α 可导致TRPV2通道的mRNA 和蛋白质表达水平明显上调（P＜0.05），见图4。

Fig.4 Effects of TNF-α with different concentrations on the expression of HODs-like cells图4 不同浓度TNF-α处理对HODs样细胞的影响

2.4 TNF-α 对 HODs 样细胞中 TRPV2 通道蛋白的作用 与对照组（18.7%）相比，加入TNF-α 处理24 h后，TRPV2通道阳性染色细胞数目（69.4%）显着增加，见图5。

Fig.5 Results of flow cytometry for the effect of TNF-α on the expression of TRPV2 ion channel图5 流式细胞术检测TNF-α对TRPV2离子通道表达的影响

2.5 TNFRs 在 TNF-α 调控TRPV2通道中的作用 RT-qPCR和WB测定结果显示，10 μg/L TNF-α可明显上调TRPV2 通道的mRNA 和蛋白质表达水平，而这种上调作用可以被R-7050抑制。甚至在使用R-7050后，TRPV2通道的mRNA和蛋白质表达水平低于对照组（P＜0.05），见图6。

Fig.6 Gene and protein expressions of TRPV2 channel in HODs-like cells treated with TNF-α图6 TNF-α处理HODs样细胞TRPV2通道的基因和蛋白质表达

3 讨论

3.1 TRPV2 离子通道的作用及存在部位 TRPV2离子通道是TRPV 亚家族成员之一，也是人体重要的感受器之一，可被较高的热刺激激活（＞52 ℃），提示其可能作为一种高阈值热伤害性感受体存在［4］。最近有研究报道，TRPV2 离子通道还可以感受低渗透压、机械刺激以及化学刺激等［5-6］。TRPV2离子通道在组织中分布广泛，主要在感觉神经元中表达，也存在于血管平滑肌、脾、胰腺等其他组织。目前研究认为其在不同组织细胞中可能发挥不同的作用，特别是与疼痛和免疫反应密切相关。由于HODs的极性细胞突起紧密嵌入牙本质小管中，很难从牙髓中分离出完整的、生物活性高的HODs，而HODs 属于高度特异的终末分化细胞，常规体外条件下尚无法进行培养增殖。因此诱导牙髓干细胞形成的HODs样细胞被广泛用于代替正常HODs 细胞用于科研。本研究通过诱导体外培养的人牙髓组织细胞，获得在形态和功能上与体内HODs相似的HODs样细胞，且表达HODs 相关的特异性蛋白，如DSPP 和nestin等。同时，在矿化液的诱导下，细胞呈复层生长并可形成矿化结节，进一步证实该细胞具有形成牙本质的能力［7］，这也是目前研究HODs样细胞常用的方法。

3.2 不同浓度TNF-α 对TRPV2 通道基因和蛋白质表达水平的影响 研究显示，在深龋近髓的牙本质中或中早期牙髓炎症的牙髓中TNF-α 检出率很高［8］。因此本研究采用TNF-α作为刺激因子作用于TRPV2蛋白，且选择了1 μg/L和10 μg/L 2个不同浓度代表不同的炎症程度，从而用来推测TRPV2蛋白在炎症相关牙体牙髓疾病中可能的功能。本研究首先通过免疫荧光染色证实TRPV2 蛋白在建立的HODs样细胞模型中表达，继而用3种分子生物学方法从不同角度进一步证实TNF-α 能够明显上调HODs 样细胞中TRPV2 通道mRNA 和蛋白表达水平。通过RT-qPCR 和WB 对比不使用和分别使用低、高浓度的TNF-α 时TRPV2通道基因和蛋白质的表达水平变化，结果证实高浓度TNF-α能够明显上调HODs样细胞中TRPV2通道的基因和蛋白表达水平，而低浓度TNF-α对TRPV2通道基因和蛋白质的表达无明显影响。流式细胞术结果也充分表明，TNF-α 处理后TRPV2 通道蛋白阳性表达的细胞数量明显增多，亦证明了TNF-α对TRPV2通道蛋白表达的增强作用。以上实验结果提示，在一些牙体组织或牙髓疾病，如深龋或早期牙髓炎症中TRPV2通道表达可能会明显上调，从而介导HODs 对外界反应增强。而TRPV2通道对低、高浓度TNF-α表现的不同反应可解释为TRPV2 通道的活性可能与炎症程度有关，炎症程度越重，TRPV2 通道的活性越高，对外界刺激的反应越强。这一点与临床症状也相符合，即在深龋或可复性牙髓炎情况下，牙髓组织对外界的温度或机械等刺激的反应明显增强，导致疼痛难以忍受，本研究结果表明，TRPV2可能参与了这一复杂过程。

3.3 R-7050 对TRPV2 通道基因和蛋白表达的影响 TNF-α 主要通过细胞膜上的多种TNFRs 发挥生物效应［9］。TNF-α与细胞表面的TNFRs结合进而激活下游信号通路，表现特异性促炎反应，其中最常见的是TNFR1和TNFR2。R-7050是TNFR1信号传导的特异性抑制剂，不影响TNF-α与TNFR结合，而是通过阻断TNFR1 与细胞内衔接分子的结合从而抑制TNF-α 激活MAPK 信号通路。本研究中，RT-qPCR 和 WB 均显示 R-7050 明显抑制了 TNF-α 对TRPV2通道基因和蛋白表达的上调，表明TNFR1可能在该过程中起主导作用。然而，在加入R-7050后，TRPV2 通道基因和蛋白质表达水平却低于不使用R-7050 的对照组，具体原因仍不明确，我们推测R-7050可能通过与TNFR无关的脱靶效应而发挥某些保护作用［10］。

综上所述，TNF-α 作为在深龋和早期牙髓炎症组织中常见的炎症因子，在牙髓组织炎症发生发展过程中有重要作用，本研究结果显示其能够明显上调成HODs 样细胞中TRPV2 离子通道表达水平，提示TNF-α可能通过调控类似TRPV通道表达水平来改变牙髓组织对外界刺激反应程度，从而有助于更深入地了解牙髓疼痛感觉传导机制。