长链非编码RNA调控胃癌转移的研究进展

王林，文坤明，黄声凯，孙跃民，3△

胃癌是人类第五大常见癌症，死亡率位居恶性肿瘤第4位［1］。由于早期临床症状不典型，大部分胃癌患者初诊时已发生转移［2］。转移性胃癌预后较差，即使经过手术、放化疗等综合治疗，患者的5年生存率仍不到50%［3］。胃癌转移涉及复杂的侵袭-转移级联过程，通过获得分子和表型的变化，癌细胞在局部侵袭周围组织，诱导血管生成以及免疫逃逸后才能增殖，成为临床可检测的显性转移灶［4］。近年来，越来越多的长链非编码RNAs（LncRNAs）被发现在生理发育和疾病发生过程中具有重要作用［5］。研究表明，LncRNAs的异常表达与包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的生长、侵袭、转移密切相关［6］。本文总结了LncRNAs在胃癌转移中参与的生物学过程和作用机制，旨在为胃癌转移的研究提供理论依据以及为临床诊断、治疗提供新方向。

1 LncRNAs参与胃癌转移过程中的生物学作用

在侵袭-转移级联过程中胃癌细胞经历上皮-间质转化（EMT）、诱导肿瘤血管生成、免疫逃逸等生物学过程，LncRNAs在其中的调节作用十分重要，其不仅能正向促进胃癌转移，还具有负向抑制胃癌进展的能力［6］。

1.1 LncRNAs调节EMT过程影响胃癌侵袭转移 EMT最初是在器官发育、组织再生、伤口愈合以及器官纤维化中观察到的生物学过程，近年来研究表明该过程有助于癌细胞转移［7］。EMT是一个多步骤、具有可塑性和可逆性的复杂过程，在此过程中上皮细胞失去细胞间的紧密连接并经历细胞、分子和生化的改变，特异性地引起E-钙黏蛋白（cad）表达下调，N-cad和波形蛋白（Vimentin）表达上调，间质表型增加、上皮表型降低，细胞侵袭性及迁移能力增强［7］。EMT涉及程序调控的分子网络十分复杂，各种细胞外刺激、经典的生长因子以及转化生长因子（TGF）-β/Smad、WNT/β-连环蛋白（β-catenin）、Janus蛋白酪氨酸激酶（JAK）/信号转导及转录激活蛋白（STAT）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶（AKT）、核因子-κB（NF-κB）信号通路等均可参与EMT发生。这些细胞信号通路的激活促使特定的EMT转录因子（如Snail家族、Twist家族、ZEB家族）、非编码RNA、表观遗传和翻译后修饰因子的表达，共同协调深层的基因表达重编程［8］。

研究发现，通过改变胃癌肿瘤细胞内LncRNAs的表达，可以诱导EMT重编程，进而影响转移的发生［8］。Lnc-CTSLP4在胃癌组织中表达下调与肿瘤的局部浸润、淋巴结转移、TNM分期相关，AGS和MGC803细胞转染过表达Lnc-CTSLP4载体后，细胞间质特性和侵袭迁移能力减弱；且Lnc-CTSLP4的表达升高显着诱导了EMT的关键转录因子Snail和N-cad表达降低以及E-cad升高［9］。Liu等［10］研究表明，胃癌细胞中过表达LncRNA FGD5-AS1可诱导Smad6蛋白水平的升高，导致骨形态发生蛋白（BMP）途径中Smad1/5/8复合物的磷酸化受到抑制，进而胃癌细胞不能向间质表型转化，转移能力降低。另外，LncRNA还能诱导EMT过程，促进胃癌转移。NR2F1-AS是与EMT高度相关的LncRNA，随着胃癌的进展，其表达量逐渐升高［11］。NR2F1-AS可诱导普列克底物蛋白同源类结构域家族B成员2（PHLDB2）的表达。PHLDB2是一种具有PH结构域的蛋白质，作为Notch通路的下游靶点在胃癌中刺激AKT信号通路诱导EMT，促进胃癌细胞的增殖、侵袭［11］。通过调控EMT影响胃癌转移的LncRNAs还包括促进EMT的DLEU2［12］以及抑制EMT的LINC00332［13］和MIR503HG等［14］。这类RNA分子可能成为治疗胃癌转移的有效靶点。

1.2 LncRNAs调节血管生成和血管生成拟态促进胃癌转移 肿瘤细胞向远处的器官定植还需血管系统的支持。但在肿瘤发生的初期并没有构建血管网络，癌细胞的大量增殖导致实体肿瘤内部的细胞缺血、缺氧。在这样的微环境下刺激癌细胞上调多种血管生成相关生长因子的表达并释放到微环境中以吸引内皮细胞向肿瘤迁移，内皮细胞在接收到血管生成相关因子信号后会分泌多种酶降解毛细血管或毛细血管后小静脉（动脉）基底膜中的蛋白质，随后迁移到肿瘤内部并以单列的形式增殖，最终内皮细胞通过变形、融合萌发出新的毛细血管网络［15］。新生肿瘤血管不但为癌细胞提供了必要的营养物质和氧气，且由于肿瘤血管结构和功能的异常，血管基质不完善，易被肿瘤细胞穿透，所以这些血管网络也为癌细胞的转移提供了有利条件［16］。许多分子和信号通路参与了肿瘤血管生成过程，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因 子-2、基质 金属蛋白酶、LncRNAs、Wnt/βcatenin、NF-κB等信号通路［17］。Xu等［18］研究发现NEAT1促进胃癌的转移可能是诱导了肿瘤的血管生成：在胃癌细胞系中沉默NEAT1的表达后，血小板衍生生长因子-B、血管内皮生长因子-1、前列腺素F-2等血管生成相关因子的表达也显着降低；体外实验表明沉默NEAT1的胃癌细胞上清培养液能够明显抑制人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和管状形成；在裸鼠异种移植瘤模型中，沉默NEAT1后小鼠的肝转移率显着降低，血管内皮细胞标志物CD31表达下调。此外，LncRNA SNHG22也可能通过诱导胃癌血管生成以提供营养和结构的支持，调节胃癌细胞的增殖和迁移［19］。

目前，靶向抗血管生成治疗已成为晚期胃癌的推荐治疗策略，然而疗效仍十分有限。这可能是由于在抗肿瘤血管生成治疗的同时，加重了低氧微环境对肿瘤的刺激，从而诱导了癌细胞血管生拟态（VM）网络的产生。VM是由恶性肿瘤细胞直接构成的与循环系统相通的血管样网络，肿瘤细胞直接与血液接触，因此更容易进入循环到达远处组织形成转移灶［20］。浆细胞瘤变异体易位1（PVT1）是一种研究较为广泛的LncRNA。Zhao等［21］发现PVT1不仅可以通过诱导血管生成来加速胃癌进展，还可以诱导胃癌VM形成，过表达PVT1的小鼠异种移植瘤组织中不仅有丰富的CD31阳性的内皮细胞血管网络，且移植瘤倾向于形成更多的VM通道。此外，采用体外基质胶培养胃癌细胞发现PVT1刺激了更多VM通道的萌发［21］。可见LncRNAs不仅可以影响胃癌的血管生成，调节VM形成也是促进胃癌转移的重要途径。

1.3 LncRNAs调节免疫逃逸影响胃癌转移 肿瘤细胞生长和转移会诱导免疫抑制，避开免疫系统的识别和攻击。肿瘤的免疫抑制通常是诱导免疫抑制细胞聚集在肿瘤周围，分泌免疫抑制因子从而降低肿瘤细胞的免疫耐受性，亦或诱导免疫抑制分子受体的表达促进肿瘤细胞免疫逃逸［22］。近年来，程序性死亡受体-1（PD-1）在肿瘤免疫研究领域备受关注。PD-1是在多种免疫细胞中表达的免疫球蛋白，当PD-1与其配体结合时，可激活细胞内信号通路抑制免疫细胞激活，减少免疫细胞分泌抗体和细胞因子甚至耗竭免疫细胞，从而导致抗肿瘤免疫退化。细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）是第一个被发现的PD-1配体，除在巨噬细胞、一些激活的T细胞和B细胞表达外，其在肿瘤细胞中表现出异常高表达，被认为是促进肿瘤免疫逃逸能力的主要因素［23］。LncRNA SNHG15在胃癌中的表达水平与PD-L1呈正相关，并可促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移［24］。此外，有研究将过表达SNHG15的胃癌细胞以及对照细胞与外周血单个核细胞（PBMC）共同孵育后发现，过表达SNHG15的胃癌细胞凋亡率显着降低，SNHG15促进胃癌细胞免疫逃逸［25］。LncRNA UCA1不仅可抑制miR-26a等促进胃癌细胞增殖、迁移，其上调胃癌细胞的PD-L1水平抑制宿主免疫系统也是胃癌发生转移的关键步骤［26］。在肿瘤的进程中，肿瘤细胞会产生和分泌一系列有益于自身生存的信号分子以诱导免疫细胞向促进肿瘤生长、转移的细胞亚型极化［27］。Xie等［28］发现胃癌组织中表达上调的LncRNA ANCR通过促进叉头转录因子1（FoxO1）蛋白泛素化降解，抑制巨噬细胞向M1亚型极化，促进胃癌细胞转移。目前，诸如此类的LncRNA还在不断被发现，为胃癌的免疫治疗提供新思路［29］。

2 LncRNA调节胃癌转移的分子机制

目前，对于LncRNAs的研究仍处于初级阶段，大量的LncRNAs还未被挖掘加以功能的注释［6］。LncRNAs可通过与其他生物分子间的相互作用，在表观遗传、转录、转录后、翻译以及翻译后修饰水平调节多种生理、病理过程的发生［30］。

2.1 胃癌转移中LncRNA与RNA相互作用 在研究胃癌转移的分子机制时发现，LncRNAs与miRNAs相互作用构成的ceRNA网络是重要的细胞转移调节方式，LncRNAs以自身含有的miRNA反应元件竞争结合miRNAs并抑制后者的活性，从而调节基因的表达［31］。LncRNA SND1-IT1可竞争性结合miR-124调节Ⅳ型胶原蛋白α1（COL4A1）的表达，进而参与TGF-β对胃癌EMT的促进作用，影响胃癌转移［32］。Huangfu等［33］发现LINC00205在胃癌中高表达，LINC00205可通过靶向结合miR-26a来加快胃癌细胞周期进程并通过EMT促进转移。

2.2 胃癌转移中的LncRNA与蛋白质相互作用 LncRNA以自身的特异性序列和蛋白质RNA结合域相互作用，可调节蛋白质翻译后修饰或影响基因的表达，甚至其相互作用还可以维持各自的稳定性或直接形成复合物参与细胞生命过程。BDNF-AS是与胃癌腹膜转移和铁死亡相关的LncRNA，其通过与甲基化蛋白WDR5结合抑制基因的表达［34］。Huang等［34］发现在敲低BDNF-AS和WDR5的胃癌细胞中E3泛素连接酶FBXW7基因启动子区域CpG岛甲基化水平明显降低，并伴随FBXW7蛋白的表达下降，而过表达BDNF-AS和WDR5则观察到相反的结果。FBXW7还可诱导铁死亡相关蛋白电压依赖性阴离子通道蛋白3（VDAC3）泛素化降解。当胃癌中VDAC3不能正常降解时，铁离子、活性氧、谷胱甘肽等物质的代谢异常活跃，最终导致胃癌细胞发生转移，产生抗铁死亡作用［35］。

LncRNAs与蛋白结合除调控基因表达外，还可以直接调节蛋白翻译后修饰。蛋白质泛素化广泛参与细胞的所有生命活动，在蛋白质降解过程中起重要作用。Ou等［36］将过表达LINC00893的胃癌细胞经过转录组测序后对差异基因进行基因本体（GO）富集，结果显示LINC00893可与蛋白质结合而发挥作用。随后，使用StarBase数据库预测到LINC00893可结合RNA结合蛋白Fox-1同源物2（RBFOX2），并用免疫共沉淀联合免疫印迹进行了验证。RBFOX2是多梳抑制复合物2募集到活性基因的核调节因子，以介导基因的转录提高相应蛋白的表达。胃癌细胞中过表达LINC00893会导致RBFOX2蛋白表达降低，此作用可被蛋白酶体抑制剂MG132拮抗。同时，泛素化测定显示LINC00893过表达增加了胃癌细胞中泛素化RBFOX2蛋白的水平。LINC00893和RBFOX2在胃癌细胞中同时过表达时，LINC00893抑制细胞增殖、迁移和侵袭作用明显减弱［36］。这些验证均表明LINC00893结合并诱导RBFOX2泛素化降解可靶向EMT抑制胃癌的转移。

在蛋白质翻译后修饰中，LncRNA还能直接结合蛋白分子调节蛋白质的磷酸化。DNA依赖的蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）是lnc-LEMGC抑制胃癌细胞转移所必需的。然而，转录谱分析却表明lnc-LEMGC并不调节DNA-PKcs的表达水平，改变lnc-LEMGC表达后DNA-PKcs蛋白总量没有显着差异。但是磷酸化分析发现过表达lnc-LEMGC抑制了DNA-PKcs（Ser2056）的磷酸化水平，沉默lnc-LEMGC提高了DNA-PKcs的磷酸化水平。lnc-LEMGC抑制DNA-PKcs的磷酸化后果是引起表皮生长因子受体（EGFR）通路的信号转导受到抑制，进而影响胃癌转移［37］。

LncRNAs作为连接或聚集多个蛋白质的分子支架，通过与蛋白结合调节蛋白分子在细胞中的定位也是LncRNA调节胃癌转移的重要机制。如LncRNA THAP7-AS1介导Cullin蛋白4B（CUL4B）进入细胞核促进胃癌的进展，CUL4B是Cullin4B-RingE3泛素连接酶复合体的骨架蛋白，其核定位是发挥生物学功能的前提［38］。Liu等［39］发现THAP7-AS1基因5′端的1-442位核苷酸与CUL4B的核定位信号区相互作用，促进后者入核，并激活下游PI3K/AKT信号促进胃癌进展。研究发现，在胃癌中表达上调的LncRNA NR038975在过表达或敲低后的转录组分析中显示与胃癌的转移相关，通过RNA下拉、RIP、缺失映射和共定位分析表明NR038975与核因子复合体NF90/NF45间存在直接相互作用［40］。NR038975与NF90连接提高了自身序列的稳定性，NR038975作为NF90/NF45分子连接支架还稳定了NF90/NF45复合体调节胃癌转移的能力。此外，NR038975还被胃癌细胞来源的外泌体包裹分泌到患者的外周血，在血清中表达升高，可作为胃癌的诊断标志物［40］。

3 小结与展望

尽管大量研究表明LncRNAs靶向不同的分子和信号通路影响了胃癌转移过程中的多种生物学途径，但LncRNAs的具体功能和调控胃癌转移的详细机制仍未完全明确。目前研究LncRNAs功能机制的实验对象大部分是离体细胞，LncRNAs可否作为胃癌转移的治疗靶点尚缺乏足够的临床数据支撑。此外，已知与胃癌转移相关的LncRNAs较多，如何筛选及验证调控胃癌转移的LncRNAs及其能否结合临床指标建立预后预测模型，指导个体化治疗都是亟待解决的问题。期望今后更多有效研究手段能被开发以揭示LncRNAs调控胃癌转移的机制，为胃癌的诊断和治疗提供新策略。