细胞自噬在急性呼吸窘迫综合征中的研究进展

黄承军，徐宇，秘乐，王秀军，刘振峰，王红嫚△

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是继发于内皮-上皮屏障破坏、白细胞过度跨上皮迁移、促炎细胞因子过度产生的急性呼吸系统疾病，以毛细血管通透性过度增加导致双肺非心源性水肿伴严重低氧血症为特征［1］。该病总病死率高达35%～46%，但目前尚无统一且有效的治疗措施［2］。因此，深入研究ARDS 的发病机制，寻找有效的治疗靶点对ARDS 的防治具有重要意义。炎症反应的失控是ARDS 进展的关键。有研究发现，细胞自噬通过调节细胞功能、介导细胞因子的表达释放对炎症进程有重要影响［3］。Liu等［4］在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）气管滴注构建的小鼠肺泡巨噬细胞炎症模型中，采用间充质干细胞外泌体抑制细胞自噬后，发现炎症反应减轻。然而，Li等［5］在盲肠结扎穿孔诱导的脓毒性小鼠急性肺损伤（acute lung injury，ALI）中，予以细胞外囊泡抑制细胞自噬后，小鼠肺损伤加重。自噬对ARDS 炎症反应是促进还是抑制作用，可能与ARDS的诱因和各个病理阶段最适自噬程度有关。本文就细胞自噬发生机制及其在ARDS中的作用进行综述。

1 自噬及其主要机制

自噬是真核细胞中老化细胞器或侵入胞内病毒、细菌等大分子物质的唯一降解途径［6］。因此，自噬为细胞的生长肃清了障碍［7］。自噬包括巨自噬、微自噬及伴侣介导的自噬，其中巨自噬最常见，其过程大致可分为自噬诱导、自噬体的组装和形成、自噬体与溶酶体的融合以及囊内产物的降解4个阶段［8］。20 世纪90 年代随着调控自噬相关基因ATG1-16的发现［9］，自噬机制的研究进入分子水平。研究发现自身免疫疾病、癌症、神经退行性病变等均与自噬缺陷或过度自噬密切相关，尤其对宿主防御至关重要，自噬一方面通过自噬小泡对胞内病原体包裹，将其输送到溶酶体进行降解；另一方面可通过介导炎性细胞因子的产生调节炎症反应［10］。然而，自噬异常或失控也可使部分功能正常的细胞器受损或功能蛋白降解，细胞发生自噬性死亡，导致相关组织器官发生功能障碍。因此，探讨自噬的发生机制及其在疾病发生发展中的作用，对疾病防控具有重要意义。目前，自噬的发生机制尚不完全明确，可能与细胞能量代谢失衡相关，而参与调控自噬的细胞信号通路错综复杂，包括雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号通路；同时，自噬调节还与活性氧（ROS）的氧化作用和内质网应激密切相关。

1.1 mTOR信号通路 mTOR是调节细胞自噬上游信号通路的交汇点。mTOR包括mTOR1和mTOR2两个蛋白信号复合体，其中mTOR1参与调节细胞代谢、自噬、凋亡等，mTOR2与细胞骨架重组相关［11］。mTOR1的活性受细胞氨基酸及能量摄入的影响，当摄入营养充足时，mTOR1发生磷酸化并抑制自噬启动蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）的活化；而摄入缺乏时，mTOR1去磷酸化，解除了对ULK1的抑制作用；ULK1通过活化beclin1 激活磷酸肌醇3-激酶催化亚基Ⅲ型（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）复合物，PI3K 将自噬相关蛋白（autophagy-related protein，Atg）16 复合物募集到自噬体前体结合位点，促进磷脂酰乙醇胺（ptdEth，PE）与微管相关蛋白1 轻链3（microtubuleassociated protein1 light chain 3，LC3）结合，使LC3 被修饰成为LC3Ⅱ，并被锚定于脂质双分子层，PE-LC3复合物通过不断募集脂质使隔离膜延伸，最终形成封闭的双膜脂质结构的自噬体，在SNARE 跨膜蛋白的介导下，自噬体与溶酶体融合，自噬体内容物被多种溶酶体水解酶降解释放至细胞质中再利用［12］。另外，mTOR1 也可以通过磷酸化AMBRA1（自噬/Beclin1 调控因子）降低ULK1稳定性［13］、磷酸化ATG14及调节溶酶体相关基因的转录［14］，从而负向调节细胞自噬。

1.2 AMPK 信号通路 AMPK 是真核细胞重要的能量传感器，可灵敏感知细胞内腺苷一磷酸（adenosine monohosphate，AMP）/腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）比率变化，当能量缺乏、AMP/ATP 比率增加或葡萄糖剥夺时，AMPK 被激活［15］。活化的AMPK不仅可调节能量代谢，而且对线粒体裂变与融合的平衡、细胞自噬均有调节作用。在敲除AMPK的HeLa 细胞中自噬水平明显降低；自噬早期，AMPK 通过促进ULK1和beclin发生磷酸化抑制mTOR信号通路，从而促进自噬；另外，在葡萄糖剥夺条件下，AMPK与线粒体融合因子之间结合力减弱，胞质内大量活化的AMPK 呈游离状，促使AMPK与线粒体裂变因子结合并使其发生磷酸化，从而调节线粒体裂变融合平衡和线粒体自噬［16］。Guo等［17］研究发现，烟碱通过靶向GPR109A 基因，激活AMPK 信号通路，从而促进细胞自噬和核因子-E2 相关因子2（nuclearfactor erythroidderived 2-like 2，Nrf2）核输入，最终起到防治乳腺炎、修复血乳屏障的作用。

1.3 ROS 与自噬 ROS 是一种高活性的小分子物质，对DNA、蛋白质及脂质均有氧化作用，ROS 可通过氧化相关蛋白，在自噬的激活中发挥重要作用。Fang 等［18］研究发现，三氧化二砷可诱导细胞产生ROS，而ROS 的氧化作用可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中AKT和mTOR的磷酸化，从而负向调节该通路，激活细胞自噬，最终对动脉粥样硬化发挥保护性作用。另有研究报道，自噬可通过促进细胞抗氧化反应、减少线粒体的产生，从而抑制ROS的生成［19］。因此，ROS与自噬可相互影响，ROS 可促进自噬，而自噬可减少ROS 的产生。

1.4 内质网应激 内质网是蛋白质折叠、组装为成熟蛋白的场所。当机体处于应激状态或细胞内环境改变时，机体对功能成熟蛋白的需求增加，此时内质网的蛋白修饰功能相对不足，导致错误折叠蛋白或未折叠蛋白的累积；当细胞受到的刺激过强或呈持续状态，可造成内质网损伤，受损内质网被自噬囊泡吞噬降解，自噬是恢复内质网稳态最后的手段［20］。Wang 等［21］在颗粒物诱导的内皮细胞内质网应激中，给予内质网应激抑制剂4-苯基丁酸干预后，细胞自噬水平降低，细胞凋亡数量减少。Zhang 等［22］研究发现，香菇多糖可通过诱导内质网应激促进细胞自噬，从而抑制结肠癌增殖。

2 细胞自噬与ARDS

2.1 肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AM）自噬与ARDS AM约占肺泡腔常驻细胞的80%，是肺泡腔最丰富的免疫细胞［23］。AM 具有高度可塑性，可诱导分化为促炎性质的M1型和抗炎性质的M2型细胞，AM主要通过吞噬病原体、释放细胞因子直接调控炎症反应或调节其他免疫细胞功能，影响ARDS 炎症进程。近年研究发现，AM 自噬可调节细胞极化、抗原呈递和吞噬功能。Liu等［24］研究发现，老年小鼠来源的巨噬细胞自噬水平低于年轻小鼠，在LPS诱导巨噬细胞极化的实验中，加入3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬后，M1型极化更为明显，炎症反应加剧。活化的巨噬细胞高表达组织相容性复合物（MHCⅠ、MHCⅡ）抗原呈递分子，巨噬细胞加工后的抗原肽段可与抗原呈递分子结合形成复合物，再将抗原呈递给CD4+或CD8+T细胞［25］，激活产生效应T细胞，介导细胞免疫反应。Ligeon 等［26］研究发现巨噬细胞自噬通过维持吞噬体的LC3修饰，促进MHCⅡ类分子的抗原加工呈递功能。LC3 与自噬体结合后可形成一种更易与溶酶体融合的复合物，称为LC3 相关吞噬体（LC3-associated phagocytosis，LAP）。Gluschko 等［27］研究发现，巨噬细胞通过LAP靶向单核细胞增生李斯特菌，增强小鼠免疫力和巨噬细胞的抗李斯特菌活性。另外，Xu等［28］研究发现，巨噬细胞自噬通过激活NLRP3 炎性小体，增强巨噬细胞吞噬功能，促进病原体的清除。以上研究提示巨噬细胞自噬可减轻ARDS炎症反应，适当地促进巨噬细胞自噬可能成为减轻ARDS 的有效方法。

2.2 中性粒细胞自噬与ARDS 中性粒细胞是促进炎症反应和病原体清除的主要免疫细胞之一，活化的中性粒细胞通过吞噬、脱颗粒和中性粒细胞外网陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成发挥促炎和抗菌作用，而自噬对中性粒细胞的产生及其功能的发挥均有重要调节作用［9］。首先，自噬促进造血干细胞中损伤和老化线粒体的清除，降低干细胞中ROS 的累积，维持干细胞正常代谢而使其能够分化为成熟的中性粒细胞［29］。Jung 等［30］通过ATG5 基因敲除构建自噬缺陷小鼠，发现小鼠骨髓造血干细胞中线粒体过度累积，细胞出现功能障碍，外周血有核细胞数量明显减少。另外，中性粒细胞对病原体的杀伤依赖于细胞吞噬作用和ROS 的产生释放，而自噬与吞噬功能密切相关，膜识别受体在抗原刺激下被激活，诱导选择性自噬的发生，自噬蛋白LC3与单模的吞噬体结合促进吞噬溶酶体形成和成熟，吞噬功能明显增强，同时自噬有助于病原体碎片的消除［31］。研究还发现，中性粒细胞ATG5基因沉默后，细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬能力明显降低［32］。脱颗粒是指活化的中性粒细胞释放含有大量炎性蛋白和碱性磷酸酶的颗粒至细胞质，该颗粒物质具有病原体杀伤作用［33］。Bhattacharya等［34］研究发现，抑制自噬后中性粒细胞脱颗粒减少，而自噬基因敲除小鼠中，由中性粒细胞介导的炎症反应减弱。当中性粒细胞受到一定强度刺激后，细胞内膜失去完整性，核膜崩解，释放出细胞组蛋白和DNA 形成NETs，该纤维网络上密集分布着高活性的中性粒细胞弹性蛋白酶和过氧化物酶等，具有捕获并杀灭病原体的作用［33］，而自噬有助于该纤维网的形成。Guo等［35］使用海藻糖诱导中性粒细胞发生自噬后，NETs 形成增加；相反，用3-甲基腺嘌呤抑制自噬后不能有效形成NETs。以上研究提示中性粒细胞自噬可促进中性粒细胞成熟，促进病原体的清除，对ARDS有保护性作用。

2.3 上皮细胞自噬与ARDS 上皮细胞是肺暴露于外界的主要细胞，是保护肺组织免受环境侵害的机械屏障［36］。机械通气是当前治疗ARDS 的主要措施，长时间的呼吸机治疗会造成上皮细胞的应激性损伤，导致并发症发生率及病死率增加［37］。Tsai等［38］研究发现，在过氧化氢诱导的上皮细胞炎症反应中，补体调节蛋白CD46可增强细胞自噬，从而减轻炎症反应并减少细胞凋亡；而给予3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，氧化应激反应增强，白细胞介素前体（pro-IL-6、pro-IL-1β）和NLRP3 炎性小体表达水平升高，细胞凋亡数量增多，提示上皮细胞自噬可抑制氧化应激介导的炎症反应。LPS可诱导支气管上皮细胞mTOR 蛋白磷酸化，抑制细胞自噬，造成细胞炎性损伤；给予自噬抑制剂干预后促炎因子表达水平升高，细胞损伤加剧［39］。然而，也有研究发现小鼠气道上皮细胞和人支气管上皮细胞暴露于颗粒物后，细胞自噬能力增强；敲低mTOR 基因促进细胞自噬后，炎症反应加重［40］。Tan 等［41］通过抑制LPS 诱导的肺泡上皮细胞A549 过度自噬后，细胞活力增加，细胞凋亡数量减少，白细胞介素和肿瘤坏死因子等促炎因子表达水平降低。以上研究提示上皮细胞自噬在ARDS进程中具有双重作用，可以减轻或加重肺损伤，该结果取决于诱导因素及自噬程度。

2.4 血管内皮细胞自噬与ARDS 血管内皮细胞是血液与下层组织之间的一道屏障，控制血液与组织液之间的物质交换。相邻内皮细胞间的钙黏蛋白是内皮屏障的结构基础，钙黏蛋白减少可使肺组织蛋白液集聚或多种炎性细胞浸润，导致ARDS 的发生［42］。Slavin 等［43］在LPS 诱导的ARDS 小鼠模型中加入3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，肺组织中性粒细胞渗出减少，肺血管损伤减轻；在凝血酶诱导的血管内皮细胞屏障障碍模型中加入自噬抑制剂后发现，钙黏蛋白的降解被抑制，应力纤维的形成减少，有效恢复了内皮屏障功能，提示自噬可促进钙黏蛋白的降解，加重肺损伤。然而，Reglero-Real等［44-45］研究发现血管内皮细胞自噬可调节细胞黏附分子的表达及降解，以降低血管通透性，有效防止中性粒细胞的过度跨上皮迁移。此外，内皮细胞自噬可通过抑制ROS的产生降低血管的通透性，从而维持内皮屏障的完整［46］。Kong等［47］研究发现，内皮细胞自噬可激活AMPK 信号通路，促进受损线粒体的降解及重新合成，维持内皮细胞自身正常的能量代谢，进而减轻LPS对内皮黏附连接功能的损害。以上研究提示内皮细胞自噬通过调节血管通透性对ARDS炎症进程有重要影响，但其是发挥保护性作用还是损伤性作用，需进一步研究论证。

3 小结与展望

自噬是应激状态下维持细胞稳态的主要适应性反应，作为固有免疫的重要组成，在炎症调节及免疫稳态中发挥关键作用。自噬可通过调节相应细胞功能促进病原体的清除，同时也可通过抑制促炎细胞因子的产生而减轻ARDS；相反，过度自噬会使细胞发生自噬性死亡，加剧ARDS。因此，维持适度的细胞自噬有助于减轻炎症反应。目前已开发的自噬调节剂包括PI3K抑制剂、mTOR抑制剂、氯喹与羟氯喹等，其中PI3K 抑制剂3-甲基腺嘌呤、氯喹等在抗肿瘤方面的应用已进入临床试验阶段［48］，但是其在ARDS炎症性疾病方面作用的研究仍处于动物或细胞实验阶段。未来有待深入研究细胞自噬机制以及自噬对炎症的调节作用，为ARDS 的防治提供新思路。