卢建 王继成 姚翠泽 张艳霞 刘玲 骆明勇 秦丹卿
血红蛋白病是一类由于血红蛋白结构异常或者合成量不足引起的遗传性疾病，该病主要分布在热带和亚热带地区,在我国多见于广东、广西和海南等南方地区[1]。血红蛋白病可分为两种：第一种是由α-或β-珠蛋白合成量不足引起的疾病称为地中海贫血(简称地贫)；第二种是由珠蛋白的一级结构发生改变而引起的血红蛋白的分子结构发生改变的疾病称为异常血红蛋白。我国80年代对全国20个省市进行了大规模血红蛋白病的调查，显示我国的南方为异常血红蛋白高发区，其中Hb K是广东省第二常见的β-珠蛋白链异常血红蛋白病，仅次于Hb E[2]。Hb New York是由β-珠蛋白链上的点突变引起的异常血红蛋白，在血红蛋白电泳中多见于K组，是Hb K最常见的类型。Hb New York自1967年首次被发现是在纽约的一个祖籍广东的华裔美国人的家庭中，随后陆续在中国和东南亚也被发现并报道[3-5]。但对于Hb New York的临床特征的分析，尤其是合并地贫时的血液学表现的报道还比较少。我们收集了34例基因诊断为Hb New York的病例并对其进行分析，报告如下。
对象与方法
一、研究对象
2015年至2017年于广东省妇幼保健院就诊，血红蛋白电泳显示有Hb K且经基因检测确诊为Hb New York的34例患者。所有患者均为广东籍居民，年龄为19～48岁，平均为29.7岁。取其外周血用于血常规和血红蛋白电泳分析，提取外周血DNA用于珠蛋白基因检测。
二、方 法
1.血液学分析
使用EDTA-K2采血管采集受检者外周静脉血，应用Sysm ex X S.1000i全自动血细胞分析仪(日本希森美康株式会社)完成包括红细胞计数、血红蛋白量及MCV、MCH等红细胞指数的分析。采用全自动毛细管电泳仪(Capillar 2，法国Sebia公司)进行血红蛋白的分析。以上实验均按照仪器使用说明书操作。
2.常规珠蛋白基因诊断
应用厦门致善生物公司生产的磁珠法基因组DNA提取试剂盒和自动化仪器(Lab-Aid 820)提取所有病例的外周血基因组DNA。采用亚能生物技术有限公司(深圳)提供的α-和β-地贫基因检测试剂盒(gap-PCR和PCR-RDB方法)对所有DNA标本进行地贫基因检测。检测范围包括α-地贫3种常见缺失类型(-α3.7/、-α4.2/、--SEA/)和3种点突变类型(αQSα/、αCSα/、αWSα/)以及17种β-地贫的点突变。
3.β-珠蛋白基因测序
对β-珠蛋白基因(HBB)全长约2 kb分成3个片段进行引物设计和基因测序。PCR引物序列见表1。PCR扩增体系为30 μl：15 μl的Premix LA,10 pmol/μl的引物各2 μl,4 μl基因组DNA。PCR扩增反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s→60 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃延伸7 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。将PCR扩增产物送上海英骏生物技术有限公司，使用美国ABI3100 DNA测序仪双向测序。
表1 β-珠蛋白基因测序引物序列
结 果
一、异常血红蛋白Hb New York患者血液学表型分析结果
34例患者中，25例单纯的Hb New York杂合子病例的血液学表现差别不大，血红蛋白电泳提示43.9%～52.0%的Hb K异常带；1例为Hb New York合并β0-地贫，表现为明显降低的红细胞参数和升高的Hb K(91.8%)；8例为Hb New York合并α-地贫，其血液学也有不同的改变。详细的血常规和血红蛋白电泳结果见图1、表2。
二、基因检测结果
经常规地贫基因检测方法(gap-PCR和PCR-RDB)的检测，共发现5例基因型为--/αα，2例基因型为-α3.7/αα，1例基因型为αwsα/αα，以及一例β17/N。β-珠蛋白基因测序发现34例患者均检测到HBB:c.341 T>A(CD113 GTG>GAG)杂合突变(见图2A)。查询血红蛋白数据库(http://globin.cse.psu.edu/)可知此突变为Hb New York。此外一病例还检测到HBB:c.52 A>T(CD 17 AAG>TAG)杂合突变(见图2B)，与以上地贫常规检查方法检测结果相符，为Hb New York合并β17地贫患者。
讨 论
能引起珠蛋白功能改变的异常血红蛋白包括地中海贫血样变异、溶血性异常血红蛋白和氧亲和力异常性异常血红蛋白病。这些异常血红蛋白在单独存在或复合地贫时，可表现为中间型或重型地贫[6]。目前常用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和sebia capillary方法进行血红蛋白分析并发现特异性的异常血红蛋白[7]。
图1 Hb New York患者血红蛋白电泳图
A：单纯Hb New York血红蛋白电泳图;B:Hb New York合并β17血红蛋白电泳图
表2 Hb New York的血液学特征
注：MCV红细胞平均体积，MCH红细胞平均血红蛋白含量
图2 Hb New York患者地贫基因检测
A：HBB:c.341 T>A突变，即Hb New York；B：HBB:c.52 A>T突变，即β17/N
Hb New York一种血红蛋白的变异体[β113(G15)Val → Glu， GTG>GAG]，β链113号位的缬氨酸位于螺旋G15位，处于β链分子内部，是疏水性氨基酸。被酸性氨基酸谷氨酸取代后，影响了分子内部的疏水性，所以Hb New York的稳定性不如Hb A，易于降解[8]。但由于α和β接触面有3个氨基酸，接触面比较广，单个氨基酸变化可能不会对其稳定性带来明显的影响。所以该突变位点并没有影响到血红蛋白的生物学功能。通过对我们收集的病例进行血液学特征分析，单纯Hb New York的杂合子是无明显的临床症状的，且血液学指标也正常，仅血红蛋白电泳时会出现含量约50%的异常血红蛋白，这与文献报道的基本相同[9-10]，如果不进行基因测序，就可能就会被忽略。当Hb New York合并α-地贫时，除血红蛋白电泳中较高比例的Hb K外，其他血液学指标与单纯的α-地贫也是不同的。其中合并标准型(SEA)和静止型(3.7、WS)的α-地贫也有不同的血液学表现。本文中一例Hb New York合并β0-地贫的患者，表现为轻度的小细胞低色素性贫血，这与Lee和Li等[11-12]的病例报道中无贫血的症状并不相同，这可能是由于本文的病例是孕妇，存在生理性贫血的可能。
虽然Hb New York没有明显的临床表现，但其存在会干扰一些实验室指标的测定，如糖化血红蛋白、血小板计数等[13]。而且值得注意的是，由于Hb New York合并β-地贫的血红蛋白电泳检测到的Hb A比例大幅降低，容易引起误诊为重型β-地贫。在产前诊断中，这类Hb New York复合β-地贫胎儿也会因为父母亲轻型的β-地贫表现，被很少关注或者忽略。因此对Hb New York及其合并其他地贫的临床特征的认识有助于指导进一步的分子检测和产前诊断，也可以为遗传咨询提供重要的参考价值。当然包括本文在内的文献报道中，Hb New York合并其他地贫的病例还相对较少，今后我们将继续收集更多的病例，以作更具有统计学意义的比较。
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