陈彦平，张金苹
(1.北京市门头沟区中医医院内分泌科，北京 102300;2.中日友好医院内分泌科，北京 100029)
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一组以肝脏脂肪变性和异位脂肪为特征的肝脏疾病，主要病理特征为甘油三酯(triglyceride，TG)为主的脂质积聚在没有摄入过量酒精的患者肝细胞内［1］。在我国，随着肥胖率的上升，人口年龄的增长和体力活动的减少，NAFLD的患病率呈上升趋势。有研究表明，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2D)患者中，NAFLD 的患病率明显增加，NAFLD的严重程度与T2D严重程度呈正相关［2－3］。微小 RNA(MicroRNA，miRNA)是一种由18～25个核苷酸组成的小的非编码RNA分子，在信使RNA表达中具有转录后调节作用，研究发现miRNA参与了细胞的分裂、生长等生物学过程。在NAFLD患者的血清中，已经发现了如miR-34a、miR-26a等一系列 miRNA的异常表达，在动物实验中miR-26a在减弱NAFLD发展中的起着重要的作用，过量表达miR-26a小鼠的肝脏质量、肝脏TG沉积和血清谷丙转氨酶(Alanine Transaminase，ALT)水平均较对照小鼠显着降低［4－5］。沙格列汀是治疗糖尿病伴NAFLD的主要药物之一，其在控制患者血糖的同时，还可以通过影响肝脏脂质代谢而改善患者肝功能［6］，为阐明不同水平miR-26a对沙格列汀治疗糖尿病伴NAFLD的影响，本研究对不同miR-26a表达水平的2型糖尿病伴NAFLD患者给予沙格列汀治疗，观察治疗前后的部分血糖及血脂指标，报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
2015年1月～2017年12月收治的113例2型糖尿病伴NAFLD患者，男64例、女49例，49～71岁、平均(57.3±6.8)岁，体质量指数(31.3±2.9)kg/m2;所有患者均有多饮、多尿、多食和消瘦、疲乏无力等典型糖尿病症状，均符合美国糖尿病学会颁布的2016年糖尿病诊断标准［7］:FPG≥1 260 mg/L，糖耐量餐后实验血糖≥200 g/L，HbA1c≥6.5%，高血糖典型症状或高血糖危象或任意时间血浆葡萄糖≥200 g/L。2011年中华医学会NAFLD诊断标准［8］:无饮酒史或饮酒折合乙醇量＜140 g/周(女性＜70 g/周)，除外病毒性肝炎、药物性肝病等可导致脂肪肝的特定疾病，肝活检组织学改变符合脂肪性肝病或肝脏影像学表现符合弥漫性脂肪肝无其他可解释原因。排除严重心、肝等脏器功能衰竭、酒精性及其他明确原因造成的脂肪肝患者，排除恶性肿瘤及对沙格列汀过敏患者。所有患者或家属均签署知情同意书，本研究由医院伦理委员会批准实施。
1.2 方法
113例患者口服沙格列汀(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字J20110029)进行治疗(5 mg，1次/d)，疗程6个月。患者于服药1 d后抽取外周静脉血2 mL，将含有血液的试管以45～60°的角度在4℃的温度下放置1 h，然后3 000 r/min离心5 min，获得上清液，提取血清总RNA，逆转录合成cDNA后行 Real-time PCR检测miR-26a水平，以U6为内参。miR-26a上游引物序列为 5'-AAGGAGAACCCGTAGATCCG-3'，miR-26a下游引物序列为5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3';U6上游引物序列为 5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'，U6下游引物序列为5'-GTGCAGGGTCCGAG GT-3'。反应条件:95℃预变性3 min，95℃ 15 s，55℃20 s，72 ℃ 20 s，83.5 ℃ 15 s共 40个循环;最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，重复3次实验。以2－△△CT值法进行相对定量分析。以患者血清miR-26a相对表达中位数为临界值，将113例患者分为miR-26a高表达组(n=49)及miR-26a低表达组(n=64)，两组患者年龄、性别、病程等一般资料比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
1.3 观察指标
比较两组患者治疗前及治疗6个月时的空腹血糖(fasting blood-glucose，FPG)、餐后 2 h血糖(2h-postprandial blood glucose，2hPPG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)、总胆固醇(total cholesterol，TC)及TG水平;比较沙格列汀对两组患者NAFLD的治疗效果。NAFLD疗效评价:显效为患者临床症状减轻或消失，B超检查显示脂肪肝的征象有明显的减轻，患者肝功能恢复正常，血脂下降超过30%;有效为患者临床症状减轻，B超检查显示脂肪肝的征象有减轻，患者肝功能有改善，血脂下降超过10%;无效为患者临床症状无变化，总有效=显效+有效。
1.4 统计学方法
数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，两组间数据比较采用t检验。计数资料采用例数(%)表示，数据比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清FPG、2hPPG及HbA1c水平
治疗前两组患者血清FPG、2hPPG及HbA1c水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后两组患者血清FPG、2hPPG、HBA1c水平均较治疗前显着降低(P＜0.05)，但治疗后两组患者血清FPG、2hPPG、HBA1c水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。
表1 治疗前后两组患者血清FPG、2hPPG及HbA1c水平比较(±s)Tab.1 The effect of saxagliptin on the levels of FDG，2hPPG and HBAlc
表1 治疗前后两组患者血清FPG、2hPPG及HbA1c水平比较(±s)Tab.1 The effect of saxagliptin on the levels of FDG，2hPPG and HBAlc
(1)与治疗前比较，P＜0.05
指标 miR-26a高表达组(n=49)治疗前 治疗后miR-26a低表达组(n=64)治疗前 治疗后FPG(mmol/L) 9.58±2.01 6.21±1.32(1) 9.47±1.99 6.19±1.26(1)2hPPG(mmol/L) 15.02±1.93 9.03±0.90(1) 14.92±1.83 8.91±0.88(1)HbA1c(%) 8.33±0.68 6.11±0.49(1) 8.18±0.61 6.09±0.47(1)
2.2 血清ALT、AST、GGT、TC及TG水平
治疗前两组患者血清 ALT、AST、GGT、TC及TG水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后两组患者血清ALT、AST、GGT、TC及TG水平均较治疗前显着降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，但治疗后两组患者血清 ALT、AST、GGT、TC及TG水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。
表2 治疗前后两组患者肝功能及血脂指标比较(±s)Tab.2 The effect of saxagliptin on the levels of ALT，AST，GGT，TC and TG
表2 治疗前后两组患者肝功能及血脂指标比较(±s)Tab.2 The effect of saxagliptin on the levels of ALT，AST，GGT，TC and TG
(1)与治疗前比较，P＜0.05
指标 miR-26a高表达组(n=49)治疗前 治疗后miR-26a低表达组(n=64)治疗前 治疗后ALT(U/L) 35.64±20.02 17.14±4.53(1) 36.44±21.20 24.03±4.61(1)AST(U/L) 28.02±11.02 19.87±8.43(1) 27.96±11.56 23.97±9.72(1)GGT(U/L) 55.01±29.23 27.13±17.13(1) 54.52±31.14 34.12±16.98(1)TC(mmol/L) 5.35±0.72 4.10±0.68(1) 5.41±0.63 4.91±0.59(1)TG(mmol/L) 3.12±0.30 1.09±0.29(1) 3.06±0.35 1.34±0.31(1)
2.3 疗效
113例患者治疗NAFLD的总有效率为73.5%，miR-26a高表达组治疗NAFLD的总有效率83.7%，miR-26a低表达组治疗NAFLD的总有效率为65.6%，两组患者NAFLD疗效比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。
表3 两组患者NAFLD疗效比较(n，%)Tab.3 The therapeutic effect of saxagliptin on NAFLD
3 讨论
近十年来，人们对miRNA在包括NAFLD在内的多种疾病的诊断和疗效评估价值方面的兴趣日益浓厚［9－10］。在NAFLD的相关研究中，已经检测了NAFLD中的miRNA表达模式，并且已经提出了几种miRNAs作为这种疾病的预测因子［11］。既然miRNA可能作为NAFLD的预测指标，那么miRNA的表达水平可能也制约着NAFLD患者对药物的反应性。因此，本研究探究了miR-26a差异表达的糖尿病伴NAFLD患者对沙格列汀的临床敏感性，结果发现，miR-26a的差异表达并不会影响糖尿病患者的血糖控制(P＞0.05)，但是沙格列汀在miR-26a表达较高的患者取得了更好的NAFLD治疗疗效(P＜0.05)，提示miR-26a作为沙格列汀的疗效具有一定的指示作用。
沙格列汀是用于治疗成人2型糖尿病的二肽酰基肽酶(dipeptidyl peptidase，DPP-4)抑制剂，主要作用于肠降血糖素系统，其作用位点包括葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gastric inhibitory peptides，GIP)和胰高血糖素样肽-1(glucagon-1，GLP-1)。GLP-1和GIP响应于食物摄取，从肠中的细胞分泌，并通过不同的受体作用于胰腺β-细胞，以葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素的释放，GLP-1还以葡萄糖依赖性方式抑制胰腺α细胞的胰高血糖素分泌，调节胃排空，并作用于中枢神经系统以减少食物摄入［12］。近年来的研究表明DDP-4抑制剂可在控制血糖的同时，改善患者的血脂和肝功能［13］，这些发现与本研究中沙格列汀治疗下患者 ALT、AST、GGT、TC及TG改善相一致。DPP-4抑制剂可能通过影响肝脏脂质代谢来减少脂肪合成，而肝脏脂质代谢异常是NAFLD的重要原因。
目前的研究发现TG代谢异常是诱发NAFLD的关键，而miR-26a家族是控制TG等脂质代谢的重要miRNA家族［14］。miR-26a的基因组位点定位于编码C-末端结构域RNA聚合酶II多肽A小磷酸酶家族的蛋白质的基因的内含子中，在动物实验中发现，miR-26a的表达下调可造成调节脂肪生成的关键蛋白胰岛素诱导基因1过度表达，造成脂肪酸过度合成和TG的积累［15］，说明miR-26a在脂质代谢过程中发挥着重要的调节作用，在本研究中也发现了miR-26a高表达的患者经沙格列汀治疗后血脂指标TC、TG的改善更明显(P＜0.05)，说明miR-26a激活造成脂质代谢改善可能是沙格列汀治疗NAFLD的重要机制之一。
综上所述，本研究发现miR-26a表达并不影响沙格列汀的血糖改善功能，高miR-26a表达的糖尿病伴NAFLD患者对沙格列汀治疗的敏感性更高，可获得更明显的肝功能和血脂指标改善，血清miR-26a表达监测有作为沙格列汀治疗糖尿病伴非酒精性脂肪肝患者疗效早期预测的生物标记物的潜力。
