三种淀粉样前体蛋白胞外结构域突变体的建立及功能验证*

张鹏， 崔冬冰， 舒莉萍**， 范安然**

(1.贵州医科大学 细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室, 组织工程与干细胞实验中心， 贵州省再生医学重点实验室， 贵州 贵阳 550004; 2.中国医学科学院 成体干细胞转化研究重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

阿尔茨海默综合征(alzheimer's disease,AD)是最常见的一种神经退行性疾病，也是痴呆症的最常见类型，全球范围内每7 s就有一个AD新病人产生[1]。尽管AD的病原学以及病理学传播机制仍存在很大争议，但是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)及其加工被认为在AD的发病机制中起着重要作用[2]。APP是一种I型跨膜蛋白，是AD病人大脑中淀粉样斑块中的β-淀粉肽的来源[3]，但对APP的各个结构域的空间结构、以及各个结构域怎样通过与其他分子相互作用发挥功能仍不清楚[4]。APP的胞外结构域，特别是可以与多种胞外蛋白相互作用的E1和E2结构域 (extracellular domain 1,extracellular domain 2)，可能是APP激活信号通路及发挥生理学功能的重要原因[5]。因此，为研究APP胞外结构域的功能，本研究建立了3种表达APP胞外结构域突变体的细胞株及表达野生型APP的细胞株，并对这几种细胞株是否可以作为APP结构域功能研究的有利模型进行筛选，报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

DMEM基础培养基、细胞培养用血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25%胰消化酶、100×非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇及100 000 U/L青链霉素均来自Gibco公司，FuGENE 6质粒转染试剂购自Roche公司，6E10抗体、G418及β-巯基乙醇购自Sigma公司，羊抗鼠IgG来自北京索莱宝科技有限公司，24孔板、T25培养瓶及T75培养瓶购自Corning公司，质粒小提试剂盒购自天根公司；2× hot start PCR 预混液购自TAKARA公司，T4连接酶、内切酶SgfI及MluI购于NEB公司，pCMV-APP695质粒购自Addgene，CHO细胞为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1CHO细胞培养 CHO细胞系培养于T75的细胞培养瓶，并使用DMEM完全培养基进行培养，完全培养基组成包括10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、10 mmol/L β-巯基乙醇、1%谷氨酰胺及1%青链霉素；每天观察细胞生长状态， 3 d换1次液，细胞生长融合度至90%时进行传代培养。

1.2.2APP突变体片段扩增 (1)使用Touchdown PCR的方法进行APP突变体片段的扩增，25 μL反应体系： APP695质粒2 μL、PCR mix 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，最后用无RNA酶水补足体积到25 μL。Touchdown PCR包括2个阶段：阶段1为降落阶段，以比引物Tm值高10 ℃的温度作为起始退火温度进行PCR扩增，然后每经过一个循环退火温度降低1 ℃，直到退火温度降到比Tm值低5 ℃为止，共进行15个循环；阶段2为普通扩增阶段，在此阶段中，使用第1个阶段中所确定的最终退火温度进行扩增。(2)使用融合PCR构建E2结构域突变体，融合PCR是将多个基因片段连接起来的PCR方法，主要包括3个阶段：第1个阶段为常规PCR阶段，主要扩增E2上游和下游基因，反应条件和反应体系同Touchdown PCR；第2阶段为融合阶段，25 μL反应体系为上游片段 2 μL、下游片段 2 μL、PCR mix 12.5 μL、最后用无RNA酶水补足体积到25 μL，反应条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s、57 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s、进行10个循环，72 ℃延伸5 min；第3阶段是融合后扩增阶段，取第2阶段的反应管加入上下游特异性引物，进行15个循环。最后琼脂糖电泳进行验证。

1.2.3APP突变体蛋白表达检测 使用Western blot的方法鉴定稳定转染细胞系中APP突变体的表达，步骤为：配制10%分离胶10 mL，并用70%的酒精进行液封，分离胶凝好后配制4 mL浓缩胶。细胞裂解液以及上清的上样体积为20 μL，将其分别于2×上样缓冲液混匀后，置于100 ℃水浴煮10 min即可上样。指示带泳至胶底部后停止电泳，4 ℃转膜过夜。转膜完成后，取出PVDF膜，用5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相应一抗4 ℃过夜。次日取出PVDF膜用纯水漂洗3次，10 min/次。然后加入二抗窒温孵育1 h，纯水漂洗3次，10 min/次。用ECL液室温避光孵育，暗室显影。

1.2.4细胞转染 在CHO细胞生长融合度为90%时进行传代。使用细胞计数板按照1×105密度接种于24孔板中，培养24 h后换成新鲜培养液；分别将Opti-MEM 50 μL与Fugen HD 3 μL试剂混合，将APP突变体质粒1 μg与Opti-MEM 50 μL混合，然后将稀释后的质粒与稀释后的Fugen HD试剂混合后室温孵育15 min，最后加入24孔板，每孔50 μL，转染6 h后，换成新鲜培养液。

1.2.5稳定转染细胞系的筛选 在CHO细胞转染APP突变体质粒后24 h，换成筛选培养基，筛选培养基组成为完全培养基加1 g/L的G418，每天观察细胞生长状态，以未转染的CHO细胞作为对照。第7 天对照组细胞基本全部死亡，实验组部分细胞继续存活；在存活细胞融合度至90%时，胰酶消化细胞，稀释至10 000个/L，然后以100 μL/孔接种于96孔板，细胞贴壁后，在显微镜下筛选只含1个细胞的孔，并做标记，标记孔内即为单克隆细胞系。细胞融合度至90%时进行传代扩大培养，此后降低G418浓度为400 mg/L维持转基因的表达。

2 结果

2.1 APP蛋白E1结构域突变体细胞株的建立

通过Touch down PCR方法，将APP基因中编码E1结构域(extracellular domain 1)的59～608 bp片段进行扩增，获得了长度为1 502 bp的编码片段(图1A中的1～5泳道)。将E1结构域突变后的片段与pCMV6载体进行重组，使用SgfI和MluI双酶切验证，结果表明重组质粒中切出大小为1 502 bp的片段(图1B泳道1～2，泳道3～4为未酶切质粒)，证明载体进行了正确重组。最后通过G418抗性筛选出表达E1结构域突变体的单克隆细胞株并验证其表达和分泌。细胞总蛋白在75 kDa附近有杂交条带，且与预测分子量一致，证明了重组载体可以正常表达(图1C泳道1～8)。细胞培养上清液中也有与预测分子量一致的条带，证明了其可以正常分泌(图1D泳道1、3～7)。

图1 APP蛋白E1结构域突变体细胞株的建立Fig.1 The effect of ED1 deletion on APP expression and secretion

2.2 APP蛋白E2结构域突变体细胞株的建立

通过常规PCR的方法，获得了APP基因中位于E2结构域上游的基因片段，长度为873 bp；同时获得位于E2结构域下游的基因片段，长度为582 bp(图2A)，然后通过融合PCR的方法将上下游片段连接，获得了长度约为1 500 bp的E2结构域编码序列缺失的APP片段(图2B)。使用E2结构域突变的片段与pCMV6载体构建重组载体，通过SgfI和MluI双酶切获得5 000 bp和1 500 bp目的片段，证实了载体的正确重组(图2C)。通过G418抗性筛选出单克隆细胞株，使用Western blot检测细胞内和细胞培养液中dE1突变体蛋白表达，结果证实dE1突变体不仅在细胞内表达(图2D)，并且可以正常分泌到胞外空间(图2E)。

图2 APP蛋白E2结构域突变体细胞株的建立Fig.2 The effect of ED2 deletion on APP expression and secretion

2.3 信号肽在调控胞外结构域的释放

为了研究信号肽(signal peptide，SP)在APP分泌中的作用，本研究将载体通过SgfI和MluI进行双酶切，去除了大小约为3 000 bp 的APP 全长片段(如图3A泳道1)，然后与PCR获得了信号肽缺失的dE1-APP片段(图3A泳道2)连接后获得了信号肽缺失的dE1-APP重组载体(dE1-APPΔSP，图3B)。Western blot结果显示信号肽缺失后，APP虽然可以在细胞内表达(图3C)，但是不能正常分泌到细胞外空间(图3D)。

图3 APP蛋白信号肽缺失和E1结构域突变体细胞株的建立Fig.3 The effect of ED1 & SP deletion on APP expression and secretion

3 讨论

AD的主要病理学特点是大脑中形成淀粉样斑块和神经纤维结节，其中淀粉样斑块是由于APP切割产物Aβ在细胞外积累形成的，而神经纤维结是由于磷酸化的微管蛋白(Tau)沉积形成[6-7]。尽管AD的病原学以及病理学传播机制仍存在很大争议，但是由于APP或者其酶切产物可以导致Tau蛋白磷酸化、突触功能异常、神经元死亡等现象[8-9]，据此形成了APP处于AD疾病形成的中心位置的假说。所以对APP功能的研究对于揭示AD的发病机制的理解具有重要意义。因此，本研究建立起3种APP的突变体，并希望通过观察3种APP的突变体对APP蛋白的胞外分泌有无影响，探索APP结构跟功能之间的关系。

APP被α-分泌酶切割后，氨基端会释放形成可溶性的胞外结构域片段(sAPPα)和由83个氨基酸组成的羧基端(C83会继续固定在细胞膜上)。停留在细胞膜上的C83会被γ分泌酶继续切割形成P3肽段和APP胞内结构域片段(APP intracellular domain，AICD)，这个过程被称为APP的非淀粉样形成过程[10-11]。与此类似，APP还可以被β-分泌酶切割形成可溶性的胞外结构域片段(sAPPβ)以及与细胞膜结合的99个氨基酸组成的C99片段，C99片段可以被γ分泌酶继续切割形成具有神经毒性的Aβ片段以及AICD[12]。APP的这种多位点切割以及代谢产物的多样性使APP可以发挥多种生理学功能，但是也使APP的功能确定产生困难[13]。因此合适的APP功能的体外研究模型对于确定APP的正常生理功能和在AD病理学中的功能至关重要，本研究建立的几种细胞模型，都可以正常表达APP及其突变体蛋白，并且不会影响它们的正常分泌，因此可以广泛以用于APP功能的确定。

APP的功能与其结构密切相关，在过去的研究中对于APP结构以及对应结构域的具体生物学功能进行了大量研究。APP胞外结构域主要是由E1和E2两个结构域以及插入在两者之间的Kunitz结构域(KPI)以及酸性结构域(AcD)组成[14]。E1结构域中含有肝素结合亚结构域(heparan binding subdomain， HBD)，HBD具有正电荷表面，能够和带有负电荷的分子结，HBD结构域与生长因子及其受体类似蛋白的结合位点相似[15]。HBD区域可以与APP或者淀粉样前体蛋白类似蛋白(APLP之间通过二硫键形成同源二聚体或异源二聚体，从而增加APP在细胞表面的稳定性[16-17]。此外，有研究发现APP的E1结构域可以作为类生长因子促进神经节的生长[15]；Beher等[18]发现E1区域还可以与胶原蛋白I结合。E1结构域还可以作为肝素的结合位点，在APP形成二聚体的过程中发挥重要作用[19]。在E2结构域的近膜端还含有第2个HBD，其对于硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)具有低亲和力的结合能力[20]。E2与HSPG的结合可以增加APP与其低亲和性受体的结合能力[21-22]。Dahms等[23]通过结晶学手段发现E2结构域可以作为Cd2+的结合位点，与Cd2+结合后，可以增加E2结构域的稳定性。Mayer等[24]的另一项研究发现E2结构域可以通过与金属离子的结合调节APP寡聚物的形成。E2结构域也可以做作为硫化肝素的结合位点，通过与硫化肝素结合后增加APP的亲和性，从而有利于APP与其它辅因子结合[20]。尽管如此，APP的胞外结构域E1和E2的生理学作用仍有待于进一步研究，与E1和E2结构域相互作用的大量分子也有待于进一步扩充，并且不同的互作分子与E1和E2结构域结合后在AD中发挥什么作用，这些问题对于理解AD的疾病进程十分重要。本研究建立的E1和E2结构域突变体细胞株可以作为确定E1和E2结构域生物学功能、发现其互作蛋白的有效模型，在解决上述问题中起到关键作用。

APP的定位和胞内转运对于APP的加工和处理十分重要，特定基序缺失的APP，其Aβ的产生会减少[11]。APP蛋白序列中的YENPTY基序对于APP内吞和加工发挥重要作用[25]。在APP蛋白中，其1～18号氨基酸是SP序列，APP的信号肽其作用是在编码APP的基因翻译后，将APP前体蛋白导向到内质网中，APP进入内质网后会产生蛋白折叠、磷酸化和糖基化等，同时也是其进入细胞膜转运系统的关键步骤。本研究发现缺失信号肽后，尽管APP可以在细胞内表达，但是其向细胞外的分泌会受到影响。

综上所述，本研究成功构建了3种淀粉样前体蛋白胞外结构域突变体细胞株，并且通过Western blot验证了不同细胞株中APP蛋白的表达及分泌。构建的细胞株可在APP正常生理学功能和在AD病理学功能的研究中发挥重要作用。