黄瑾， 陈相好， 吴晓娟， 张峥嵘， 谷俊莹， 陈峥宏**， 崔古贞**
(1.贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004)
Ⅱ型内含子(group II introns)是一类具有自我剪接功能、可在染色体不同位置移动的反转录转座子，广泛存在于细菌、古细菌和植物的细胞器基因组中[1-2]。来源于乳酸乳球菌(lactococcuslactis)的Ll.LtrB内含子由内含子RNA和内含子编码蛋白(intron-encoded protein，IEP)两部分组成，其中内含子编码蛋白IEP由反转录结构域、成熟酶结构域、DNA结合域和核酸内切酶结构域等多个功能结构域组成[2-6]。Ⅱ型内含子发挥功能时，IEP蛋白利用其核酸内切酶活性切割靶位点，并通过其自身携带的反转录活性将内含子RNA以cDNA的形式插入到靶位点，最后细胞通过修复机制再以cDNA为模板合成互补DNA，从而将内含子RNA以DNA的形式插入到DNA靶位点[6-8]。基于Ⅱ型内含子的这种迁移特性开发出的Targetron基因打靶技术被广泛应用于多个物种的基因失活[8-19]。本研究以课题组前期建立诱导型targetron质粒为基础，选择大肠杆菌lacZ-1683a和lacZ-1874s为靶位点，构建了两种Targetron打靶载体，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后验证其功能及其效率，为下一步对Ⅱ型内含子的移动机制研究及应用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1主要试剂 高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和DNA Marker购自北京全式金公司，TRYPTONE、YEAST EXTRACT购自美国OXID公司，琼脂糖、Agar Powder、氨苄青霉素、X-gal以及IPTG购自索莱宝公司，限制性内切酶XhoI和BsrGI购自赛默飞公司，菌落PCR所使用的2×Taq Master Mix购自诺唯赞公司，DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒购自天根公司。
1.1.2菌株的培养 菌株均用LB液体培养基(1% Tryptone，0.5%Yeast Extract，1%NaCl)37 ℃进行培养，必要时加入1.5% Agar Powder配制成LB固体培养基，采用100 mg/L氨苄青霉素，蓝白斑筛选时加入40 mg/L X-gal和0.1 mmol/L IPTG。
1.1.3菌株及质粒 所用的菌株及质粒见表1。
表1 所用菌株及质粒的特征和来源Tab.1 Strains and plasmids used in this study
注：(1)表示该质粒已在生物技术通报中使用(《生物技术通报》2019年35卷6期，已录用、待发表)
1.1.4引物 引物合成由上海生工合成，详细序列信息见表2。
1.2 方法
1.2.1打靶引物设计 将大肠杆菌BL21(DE3)的lacZ全基因序列输入到在线网址(www.clostron.com)，根据评分高低，选择lacZ基因反义链第1 683位点(lacZ-1683a)及正义链第1 874位点(lacZ-1874s)作为打靶位点，在线设计程序会给出相应位点的打靶引物序列，每个位点会给出4种引物(lacZ-1683a-IBS、lacZ-1683a-EBS1d、lacZ-1683a-EBS2以及EBS Universal)，详细引物序列见表2。
表2 引物序列及描述Tab.2 Primers used in this study
1.2.2打靶载体的构建 以pSY7质粒为模板，用相应打靶位点的引物(lacZ-1683a-IBS/EBS Universal和lacZ-1683a-EBS2/lacZ-1874s-EBS1d)进行第一轮PCR，条件为95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，循环数为30，PCR产物采用琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒回收特异条带，以第一轮的PCR产物及打靶位点引物(lacZ-1683a-IBS lacZ-1874s-EBS1d)进行第二轮PCR，PCR条件同上，产物再采用DNA纯化试剂盒回收特异性条带。利用限制性内切酶XhoI/BsrGI双酶切质粒pSY7和第二轮PCR产物，通过DNA凝胶试剂盒回收，T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5a，菌落PCR鉴定及测序后获得打靶载体pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s。见图1。
图1 打靶载体pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s的构建流程Fig.1 Flow chart of Targetron vectors construction
1.2.3大肠杆菌BL21(DE3)的转化 将3 μL的质粒pSY7-lacZ-1683a、pSY7-lacZ-1874s分别加入到50 μL大肠杆菌的BL21(DE3)感受态细胞中，冰上孵育30 min，42 ℃热激90 s后，置于冰上5 min，加入900 μL LB液体培养基中，37 ℃ 180 r/min复苏1 h后，离心取细胞沉淀加入100 mg/L氨苄青霉素LB液体培养基5 mL中，37 ℃ 180 r/min过夜培养。
1.2.4打靶载体功能的检测 取40 μL过夜培养的菌液加入100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基4 mL中，37 ℃ 200 r/min进行增菌培养1 h，再加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导质粒表达45 min，离心取细胞沉淀稀释凃布LB平板(含100 mg/L氨苄青霉素、40 mg/L X-gal和0.1 mmol/L IPTG)，37 ℃过夜，挑取平板上的白色菌落和蓝色菌落进行菌落PCR验证以检测内含子序列插入基因组的特异性，通过蓝白斑计数计算打靶效率，打靶效率=白斑/(白斑+蓝斑)×100%。
2 结果
2.1 打靶载体的构建
图2A为第一轮PCR的电泳图，成功扩增出两个打靶序列0.1 kb和0.25 kb的特异性条带；图2B为进行第二轮PCR的电泳图，成功将第一轮PCR的0.1 kb和0.25 kb的产物进行了连接；图2C为所构建质粒菌落的PCR结果，可见明显的0.35 kb的打靶序列条带。通过测序，表明本研究成功构建了打靶载体pSY7-lacZ-1683a、pSY7-lacZ-1874s。
注：M为8 000 Marker，A为第一轮PCR，1为lacZ-1683a-IBS/EBSU，2为lacZ-1683a-EBS2/lacZ-1683s-EBS1d，3为lacZ-1874s-IBS/EBSU，4为lacZ-1874s-EBS2/lacZ-1874s-EBS1d；B为第二轮PCR，1为lacZ-1683a-IBS/lacZ-1683a-EBS1d，2为lacZ-1874s-IBS/lacZ-1874s-EBS1d；C为菌落PCR，1为lacZ-1683a-IBS/lacZ-1683a-EBS1d，2为lacZ-1874s-IBS/lacZ-1874s-EBS1d图2 打靶载体构建电泳结果Fig.2 Electrophoresis detection for Targetron construction
2.2 打靶载体的功能检测
如图3所示，当用打靶位点的上下游引物进行菌落PCR时，白色菌落比野生型蓝色菌落多了0.9 kb的条带大小，而且通过特异性引物进行菌落PCR，可得到相应大小的条带，表明本研究所构建的打靶载体经过诱导后，内含子序列成功的特异性地插入了相应的打靶位点。
2.3 Targetron载体的打靶效率
如图4所示，lacZ-1683a的打靶效率为(14.299±1.271)%，lacZ-1874s的打靶效率为(9.217±1.024)%。
3 讨论
来源于乳酸乳球菌的Ll.LtrB内含子是目前研究得最为广泛的细菌Ⅱ型内含子，基于其在细菌中的特异转移机制，已被开发为高效的Targetron基因打靶技术[9,14,18,20-21]。由于该技术操作简便，实验周期短，基因打靶效率高等优点，已在多种革兰氏阳性菌及革兰阴性菌中获得广泛应用[8]。根据Ⅱ型内含子的靶位点识别机制，已开发出通用的特异性打靶引物设计软件，并可利用在线设计软件(www.clostron.com)，仅输入靶基因即可自动生成特异性引物，并获得各打靶位点的评分情况；其次，在基因打靶载体构建方面，通过重叠延伸PCR获得特异性的内含子打靶序列，结合单次质粒克隆，便可获得针对目标基因的打靶载体。本研究以大肠杆菌lacZ基因为例，设计并构建了针对lacZ-1683a和lacZ-1874s两个位点的Targetron载体，通过转化、诱导及菌落PCR验证获得较好的打靶效率。总之，本研究成功构建的Targetron打靶载体为Ⅱ型内含子的机理研究及应用奠定了基础。
注：M为8 000 Marker，A为打靶载体功能检测所用引物示意图，B为插入位点外侧引物检测BL21-pSY7-lacZ-1683a 突变株、1为lacZ-1/lacZ-2引物检测BL21-pSY7-lacZ-1683a、2为lacZ-1/lacZ-2引物检测BL21(DE3)，C为特异性 引物检测BL21-pSY7-lacZ-1683a突变株、1为lacZ-1/lacZ-1683a-IBS、2为lacZ-1/lacZ-1683a-EBS2、3为lacZ- 1683a-EBS1d/lacZ-2、4为EBSU/lacZ-2，D为插入位点外侧引物检测BL21-pSY7-lacZ-1874s突变株、1为 lacZ-1/lacZ-2引物检测BL21-pSY7-lacZ-1874s、2为lacZ-1/lacZ-2引物检测BL21(DE3)，E为特异性 引物检测BL21-pSY7-lacZ-1874s突变株、1为lacZ-1/ lacZ-1874s-EBS1d、2为lacZ-1/ EBSU、 3为lacZ-1874s-IBS/lacZ-2、4为lacZ-1874s-EBS2/lacZ-2图3 打靶载体的功能检测Fig.3 Function verification of Targetron vectors
图4 Targetron载体的打靶效率Fig.4 Targeting efficiency of Targetron vectors
