家蝇抗真菌肽-1A体外抗白念珠菌的细胞内作用机制*

邓思波，黄敏慧，张迎春，吴建伟，崔古贞，2，陈峥宏*，王涛*

(1.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室，贵州 贵阳 550025)

近年来，抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)在感染性疾病治疗方面的应用受到了极大关注，其抗微生物作用机制已成为研究焦点[1-2]。研究发现，AMPs不仅能作用于微生物细胞膜，还可以通过诱导活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生、损伤细胞的DNA或线粒体等方式导致真菌等微生物细胞破坏[3-9]。家蝇抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A，MAF-1A)是由26个氨基酸残基构成的小分子阳离子多肽，其氨基酸序列结构与目前发现的AMPs不同[10]。本课题组前期研究结果显示，MAF-1A具有良好的体外抗白念珠菌(Candidaalbicans，C.albicans)活性，且作用后C.albicans的抗氧化应激相关基因、线粒体相关基因等的表达发生明显变化，表明MAF-1A能进入细胞内发挥抗菌效应，具有多靶点抗C.albicans作用[11-12]，但具体的作用机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨MAF-1A对C.albicans细胞内作用机制，为MAF-1A的开发利用提供实验依据、为抗C.albicans药物研发提供作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1MAF-1A化学合成 MAF-1A的氨基酸序列为KKFKETADKLIESAK QQLESLAKEMK委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC)固相合成法合成，高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography，HPLC)纯化、液相色谱-质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS)验证，多肽合成纯度≥98%。

1.1.2菌株C.albicans(ATCC10231)由贵州医科大学病原生物学特色重点实验室保存。

1.1.3主要试剂和仪器 沙氏葡萄糖琼脂培养基(sabouraud dextrose agar，SDA)、沙氏葡萄糖肉汤培养基(sabouraud dextrose broth，SDB)、氟康唑(fluconazole，FLC)、活性氧检测试剂盒、维生素C、还原型谷胱甘肽、真菌基因组脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取试剂盒(北京Solarbio)，线粒体膜电位(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide，JC-1)测定试剂盒(上海MCE)，ND2000超微量紫外分光光度计(美国Nanodrop)，SYNERGY荧光多功能酶标仪(贵阳奥秘商贸)，IQuant400凝胶成像系统(美国Amersham Pharmacia)。

1.2 实验方法

1.2.1菌株活化及菌悬液制备 无菌操作下取C.albicans冻存物划线接种于SDA平板，置于37 ℃温箱培养18～24 h，SDB培养基制备浓度为2×109cfu/L菌悬液。

1.2.2ROS水平检测 以终浓度为0、625、1 250及2 500 mg/L MAF-1A分别处理C.albicans24 h，以4 mg/L FLC为药物对照，按试剂盒说明加2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA)荧光试剂，37 ℃避光孵育20 min，无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次，多功能酶标仪检测荧光强度(激发波长488 nm，发射波长530 nm)。

1.2.3抗氧化剂对MAF-1A抗C.albicans活性的影响 用不同浓度(0、781 及1 560 mg/L)的维生素C(vitamins C，VC)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)预处理C.albicans30 min后，参考美国临床实验室标准化委员会(CLSI)M27-A3方法[13]，采用微量稀释法检测MAF-1A的抗C.albicans最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration，MIC)，以抑制80%C.albicans生长为MIC。

1.2.4线粒体膜电位检测 以终浓度为0、625、1 250及2 500 mg/L的MAF-1A分别处理C.albicans24 h，氧化磷酸化解偶联剂(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，cccp)为阳性对照，按试剂盒说明加JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育15 min，无菌PBS洗涤2次，多功能酶标仪检测JC-1的荧光转变，激发波长为485 nm，发射波长由525 nm(绿光，FL1)到590 nm(红光，FL2)转变，通过计算FL2/FL1比值得出线粒体膜电位的变化。

1.2.5MAF-1A与C.albicans脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)结合的凝胶阻滞分析 参考真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取C.albicans的DNA，并使用超微量紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所得DNA的浓度和纯度。将DNA溶液与不同浓度的MAF-1A(0、625、1 250 及2 500 mg/L)等体积混合，以无菌超纯水作为对照，各组混合液置于37 ℃孵育6 h，进行琼脂糖凝胶电泳(含0.01核酸染色剂)，凝胶成像分析仪观察并拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞内ROS含量

与0 mg/L组相比，不同浓度MAF-1A组C.albicans细胞内ROS量明显增加(P<0.01)，且胞内ROS 的含量随着MAF-1A浓度的增加而增加，呈剂量依赖性。见图1。

注：与0 mg/L MAF-1A组比较，(1)P<0.01；(2)P<0.001。

2.2 MIC

结果显示，MAF-1A抗C.albicans的MIC为625 mg/L；抗氧化剂GSH和VC预处理C.albicans30 min，MAF-1A抗C.albicans的MIC升高2倍，由625 mg/L增加到1 250 mg/L，即GSH和VC可使MAF-1A抗C.albicans的活性降低。

2.3 线粒体膜电位

结果显示，与0 mg/L组比较，可见cccp组C.albicans线粒体膜电位明显降低(P<0.001)，但不同浓度MAF-1A作用后，C.albicans线粒体膜电位未发生明显的变化(P>0.05)。见图2。

注：(1)与0 mg/L MAF-1A组比较，P<0.001。

2.4 MAF-1A对C.albicans DNA的影响

不同浓度MAF-1A与C.albicansDNA孵育后，可见明显的凝胶阻滞现象，大量DNA被阻滞在凝胶加样孔附近，且DNA电泳条带均出现了一定的滞后现象，并且随着MAF-1A浓度增加，DNA条带亮度减弱。见图3。

注：0为空白对照组；1～4分别为0、625、1 250及2 500 mg/L MAF-1A组。

3 讨论

ROS是生物氧代谢过程中产生的一系列活性氧簇，主要包括超氧阴离子(O-2)、羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)和单线态氧(1O2)等，通常存在于细胞内，当过多的ROS生成时，通常会产生细胞毒性，导致细胞功能异常[14-17]。正常生理状态下，C.albicans细胞内抗氧化防御系统与ROS处于平衡状态，细胞内ROS的水平维持在较低的生理范围，但当胞内产生大量ROS时，大量的ROS能导致蛋白质交联、肽链氧化以及氨基酸侧链可逆或不可逆的氧化，氧自由基反应引起的脂质过氧化可损伤细胞膜，同时也能引起的DNA损伤包括化学结构的改变、单双链的断裂与交叉连接等，进而影响其生理功能[18-22]。有研究发现，某些AMPs能诱导C.albicans细胞内ROS的含量增加，对病原体造成不可逆的损害[23-25]。本实验研究发现，MAF-1A作用后的C.albicans细胞内ROS急剧增加(P<0.01)，并呈剂量依赖性，表明MAF-1A可以诱导C.albicans细胞产生ROS；而VC及GSH作用C.albicans后，MAF-1A对C.albicans的抗菌效果明显降低，说明MAF-1A的抗菌作用能被抗氧化剂抑制，以上提示MAF-1A可通过诱导胞质内ROS的产生发挥抗C.albicans活性。

线粒体是真核细胞能量中心，对维持细胞的能量代谢具有重要作用[26-27]，而线粒体膜电位的平衡是线粒体正常运行的基本条件之一。有实验研究报道，AMPs可引起线粒体膜电位去极化，导致线粒体功能障碍，功能受损的线粒体可以通过 caspase 等途径引起细胞死亡[23,27]。但本实验结果显示，经MAF-1A作用后，C.albicans菌细胞线粒体膜电位平衡未出现较大的波动(P>0.05)，提示C.albicans的线粒体并不是MAF-1A抗菌作用的主要靶点。

研究发现，部分AMPs进入菌体细胞内，能与菌体DNA结合进而影响菌体细胞的正常生理功能，从而达到抑菌效果[28-29]。琼脂糖凝胶阻滞实验常用来考察AMPs与菌体DNA的结合作用，通过分析其电泳迁移率来分析AMPs与菌体DNA的结合情况，若AMPs与C.albicans的DNA发生结合，则其在电泳中的迁移率就会受到影响，即与单独的DNA(0 mg/L)相比，与MAF-1A共孵育的DNA条带出现滞后、变暗淡现象，且在加样孔有DNA滞留，这可能是由于MAF-1A与C.albicans的DNA链结合导致，结果表明MAF-1A进入细胞内后可与菌细胞的DNA结合，提示MAF-1A可通过结合DNA链，干扰DNA的复制等正常生理活动，进而发挥抗C.albicans效果。

综上所述，本研究认为 MAF-1A可能通过诱导C.albicans细胞内ROS的大量产生及与DNA结合作用来发挥细胞内抗C.albicans作用。