安顺地区受检妇女中高危型人乳头瘤状病毒的检出及单核苷酸多态性特征 *

席敏, 李小多, 孙广, 张海龙, 谢南子, 周琴,, 蒋红梅, 张云东*

(1.贵州医科大学 医学检验学院, 贵州 贵阳 550000; 2.安顺市人民医院 医学检验科, 贵州 安顺 561000; 3.安顺市人民医院 病理科, 贵州 安顺 561000)

宫颈癌(cervical cancer, CC)是女性常见的恶性肿瘤,其发病率与死亡率在全球女性肿瘤中排名第4[1]。在中国,CC发病率在女性肿瘤中位居第2,每年约有新发病例13万,占世界CC新发病例的28%[2]。虽然我国占全世界CC的比例有的下降,但因人口基数大、筛查普及率低,CC仍然严重威胁着我国女性健康[3]。CC的发生、发展与人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染、多个性伴侣等因素有关[4],但其中HPV病毒感染是引起宫颈病变的最重要因子。根据致癌潜力,将HPV病毒分为高危型和低危型[5],流行病学与分子证据表明,高危型HPV(high risk HPV, HR-HPV)持续性感染是宫颈高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)及CC主要致病因素[6]。女性一生均有机会感染HPV,当免疫力低下时,机体不容易清除病毒,会造成持续性感染,从而进展为宫颈病变,导致HPV分型检测、液基薄层细胞学(thinprep cytologic test, TCT)、阴道镜及组织病理学活检均可能有异常病理现象[7]。HPV感染有地域性特点,有荟萃分析显示,我国HPV感染最常见的类型HPV16、HPV18、HPV52、HPV53及HPV58[8];Chen等[9]研究结果显示贵州省HPV感染的类型依次为HPV52、HPV16、HPV58、HPV53及HPV39;约70%的CC由HPV16、HPV18型感染引起[10]。但在中国,CC前病变及CC中常见的类型为HPV16、HPV52及HPV58[11]。因此,HPV52和HPV58型感染在宫颈病变地位逐渐凸显出来。流行病学研究表明,HPV病毒突变在不同的地理位置和人群不同[7, 12],HPV52型有A、B、C及D四个谱系,B谱系主要分布在亚洲,C系在美洲和亚洲相对较多,D系在亚洲和非洲较少[13]。HPV不同谱系与不同突变导致宫颈病变的风险不同,HPV52型B系与宫颈高级别病变相关[14]。HPV的E6、E7区是主要的致癌因子,目前研究主要集中于HPV16和HPV18型E6、E7区核苷酸多态性,HPV52、HPV58主要分布于中国[15],但目前关于HPV52和HPV58型E6、E7区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)情况研究较少。本研究通过分析贵州省安顺地区HPV流行病学特征及HPV52、HPV58型的E6、E7区的SNP,以期为本地区HPV的感染防治、高级别宫颈病变筛查与诊断及针对性的疫苗研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1标本来源 选取2020年6月—2021年12月医院门诊、住院及体检患者中行HPV分型检测者,要求采样前24 h无性生活、非月经期及采样前3 d未冲洗阴道与阴道内用药。共纳入检测者10 774例,年龄15～86岁、平均(41±10.94)岁,取所有受检者宫颈脱落细胞作为细胞标本来源,取其中HR-HPV阳性且有组织病理学活检指征的298例受检者的宫颈组织为组织标本来源。本研究获得医院伦理委员会批准(〔2022〕专6号)。

1.1.2主要试剂与仪器 HR-HPV分型核酸测定试剂盒(深圳亚能生物有限公司);实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司),HPV杂交仪(深圳亚能生物有限公司),干式金属浴恒温器(西安天隆科技有限公司),漩涡振荡器(江苏康健医疗用品有限公司),高速离心机(美国Thermo Fisher)。

1.2 研究方法

1.2.1HPV DNA提取 专业妇科医生使用专用样本刷取所有检测者宫颈脱落细胞,保存于专用细胞保存液样本管中,标本采集后保存于2～8 ℃,24 h内完成检测。使用漩涡振荡器充分震荡摇匀标本细胞保存液,使宫颈脱落细胞充分混匀于细胞保存液中,一次性吸管吸取液体0.5 mL转移至 1.5 mL EP 管中,13 000 r/min离心10 min;吸掉上清液,沉淀物中加 HPV-DNA裂解液50 μL,充分混匀,100 ℃金属浴10 min;13 000 r/min离心10 min,保留上清液待用。

1.2.2聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增 HPV反应试剂取出恢复室温,取出PCR扩增试剂,900 r/min离心10 s,移液枪转移至PCR仪配套的8联管中,做好标记,加HPV DNA上清液5 μL,每次实验各设置1个阴性质控与阳性质控,900 r/min离心10 s,进行PCR扩增。扩增条件设置:50 ℃ 15 min、 95 ℃ 10 min、 94 ℃ 30 s 、42 ℃ 90 s、 72 ℃ 30 s ,72 ℃ 5 min ,共循环40次。

1.2.3变性、杂交及结果判读变性 95 ℃预变性10 min,转入冰水混合物中放置5 min,置于2～8 ℃冰箱中备用。扩增产物变性之后在按照HPV杂交仪标准操作程序完成,基本步骤:杂交→洗膜→孵育→摇洗→洗膜→显色→判读。阴性对照膜条的内标(internal control,IC)出现蓝色斑点,阳性对照膜条在相应HPV基因型位点与IC点均出现蓝色斑点,以及标本对应的每一张膜条IC位点出现蓝色斑点,表明本次实验有效。可检测17种高危型:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73及HPV82;6种低危型:HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV81、HPV83。

1.2.4组织病理学活检 取HR-HPV阳性且有组织病理学活检指征受检者的宫颈组织标本进行苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin staining,HE)。阅片由2位中级以上临床病理医师共同阅片,按照2014年WHO女性生殖系统肿瘤标准分为正常或慢性炎症、子宫颈低级别鳞状上皮内瘤变[low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL,即原宫颈上皮内瘤变1(cervical intraepithelial neoplasia,CIN1)]、HSIL(原CIN2 和部分 CIN3)及 CC(鳞癌、腺癌)[16]。

1.2.5基因测序 取“1.2.1”项下已提取好的HPV52、HPV58型DNA,低温冰冻运输至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。使用 Snapgene 将测序获得的 HPV52、HPV58型单一阳性样本E6基因和 E7基因序列与HPV52、HPV58 参考序列(HPV52 GenBank 登录号NC_001592;HPV58 GenBank 登录号 D90400.1)进行比对,分析序列突变情况与氨基酸变异情况。采用 MEGA11软件的 Align by ClustalW 对本研究中获得的 E6/E7 基因变异组序列与 HPV52 E6/E7变异谱系的参考基因组序列进行比对,参数设置为默认值。HPV52参考基因组序列:A1为X74481,A2为HQ537739,B1为HQ537740,B2为HQ537743,C1为HQ537744,C2为HQ537746,D为HQ537748[17]。HPV58型参考基因组序列:A1为D90400.1;A2为:HQ537752,A3为HQ537758,B1为537762,B2为537764,C为537774,D1为537768,D2为537770[17]。邻接法构建系统发育树,参数设置选择 Kimura2-parameter 模型,Bootstrap 值为1 000,其他参数设置为默认值。PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在线预测氨基酸序列二级结构。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0对数据进行统计分析,计数资料用例数(百分比)[n(%)]表示。

2 结果

2.1 HR-HPV感染的一般特点

HPV分型检测患者中HR-HPV感染阳性2 194例,阳性率为20.36%(2194/10774);以单一感染为主(14.0%,1509/10774),混合感染占6.36%(685/10774);HR-HPV感染亚型分布结果显示(图1),由高到低依次为HPV52(6.11%)、HPV16(3.59%)、HPV58(3.04%)、HPV53(2.31%)及HPV51(1.95%)。

图1 HPV分型检测者的HR-HPV亚型分布Fig.1 HR-HPV subtype distribution of HPV typed tester

2.2 HR-HPV感染的年龄特点

HR-HPV分型检测者中年龄≤20岁组HR-HPV感染阳性率最高(36.36%),其次是年龄>61岁组(32.30%)。见表1。

表1 HPV分型检测者中HR-HPV感染分布的年龄特点Tab.1 Age characteristics of the distribution of HR-HPV infection in HPV testing

2.3 HR-HPV感染的宫颈病变类型特点

选取同时行HPV分型检测与组织病理活检的检测者298例,宫颈病变中HR-HPV阳性最多的为HPV16型94例(CC 46例、HSIL 43例及LSIL6例),依次为HPV52型49例(CC 8例、HSIL 33例及LSIL8例)、HPV58型34例(CC 5例、HSIL 23例及LSIL3例)及HPV18型18例(CC 8例、HSIL 9例及LSIL8例)。见表2。

表2 HPV分型检测者中 HR-HPV感染的宫颈病变类型特点Tab.2 Characteristics of cervical lesion types of HR-HPV infection in HPV typing subjects

2.4 HPV52型E6、E7区的基因序列分析

根据测序结果,与 HPV52 型参考序列(NC_001592)比对结果显示,HPV52 E6/E7 基因突变率为 100.00%(30/30)。根据 E6/E7 基因序列突变差异性分组,30条序列被分为 6 个不同的变异组(52AS01～52AS06),52AS01基因突变组分布频数最高66.67%(20/30),其次是52AS02基因突变组20%(6/30)。E6基因共有7个单核苷酸突变,A125T、A294G是新的突变位点,A294T(M65G)、A378G、置前(K93G)、A379G(K93R)是非同义突变,其余突变位点是同义突变,突变位点最高的是G350T、A379G,突变率为100.00%(30/30);E7基因共有3个单核苷酸突变,均为同义突变,其中突变频率最高的位点是C751T、A801G ,突变率为100.00%(30/30),T666C是一种新的突变。E6、E7序列氨基酸二级结构未发生突变。见表3。

表3 HPV52 E6/E7 核苷酸突变及氨基酸二级结构预测分析Tab.3 Analysis of HPV52 E6/E7 nucleotide mutations and amino acid secondary structure prediction

2.5 HPV58型 E6、E7区基因序列分析

根据测序结果,与 HPV58型 参考序列(D90400.1)比对结果显示,有6例HPV58型序列未发生突变,HPV58 E6/E7 基因突变率为 72.72%(16/22)。根据 HPV58型E6/E7 基因序列突变差异性分组,22条序列被分为 7 个不同的变异组(58AS01～58AS06),58AS01基因突变组分布频数最高37.5%(6/16),其次是58AS02基因突变组18.75%(3/16)。E6基因共有3个单核苷酸突变,C321T、A388C是非同义突变,突变位点最高的是C307T,突变率为62.5%(10/16);E7基因共有8个单核苷酸突变,C632T、G694A、G760A、G761A、T803C、G806A为非同义突变,其中突变频率最高的位点是T744G突变率为81.25%(13/16),其次是G694A、G761A突变率为37.5%(6/16)。E6、E7序列氨基酸二级结构未发生改变。见表4。

表4 HPV58 E6/E7 核苷酸突变分析及氨基酸二级结构预测分析Tab.4 Analysis of HPV58 E6/E7 nucleotide mutations and predicted amino acid secondary structure

2.6 系统进化树

基因序列系统发育树结果表明(图2),安顺地区 HPV52型 E6/E7 基因突变序列均分布于B谱系,未检测到 A、C及D谱系;安顺地区 HPV58 型E6/E7 基因突变序列均分布于A谱系,未检测到 B、C 及D谱系。

注：圆点表示HPV52、HPV58突变不同序列,其余为相应不同的参考序列。

3 讨论

CC的发生发展是由CC前病变逐渐演变而来,由癌前病变发展大约10年时间,这个时间窗为早期筛查和临床干预提供了黄金时机[18]。约99%的CC合并HR-HPV感染[19]。大量队列研究已证实,HPV-DNA分型检测是用于细胞学阶段主要的筛查手段[20]。

本研究结果显示,本地区HR-HPV感染以单一感染为主,感染阳性率20.36%,较本省HPV感染率15.37%偏高[9]。可能与本研究纳入的人群主要是门诊患者有关。HPV感染频数依次为 HPV52、HPV16、HPV58、HPV53及HPV51,与本省的HPV感染优势型别HPV52、HPV16、HPV58、HPV53、HPV59基本一致[9],提示本地区CC疫苗接种应以覆盖这几型为主。HR-HPV感染年龄感染呈U字形分布,阳性率最高的为≤20岁组,可能与该年龄免疫系统尚未完全建立,以及性生活过早导致一过性感染;其次>60岁组,可能与该阶段患者免疫能力下降,对HPV病毒清除能力下降。考虑该年龄阶段免疫状况,所以该年龄阶段女性需要加强筛查。

本地区检测者HR-HPV基因型主要是HPV16、HPV52、HPV58及HPV18型。HPV16型是宫颈病变的最主要致病亚型,HPV52、HPV58型是宫颈病变中次之的优势型别,这与贵阳地区其他研究结果基本一致[21]。王丽等[22]也报道HPV16、HPV52、HPV58型感染与宫颈病变密切相关。美国阴道镜病理学会建议,HPV16、HPV18型阳性者直接转入阴道镜检查,而HPV52、HPV58型阳性者结合TCT检查异常时,被建议转入阴道镜检查并取组织活检进行病理诊断,因此,对于HPV52、HPV58型既是本地区感染的优势型别同时又是宫颈病变的危险型别,建议本地区HPV52、HPV58型感染人群应作为重点关注人群,加强筛查管理,避免漏诊及延缓诊断。

HPV16、HPV18型是已经明确了的CC的主要致病因子,因此,本研究只选取安顺地区流行的HPV52和HPV58型病例样本进行E6/E7基因测序,期望找到其在本地区致癌力强的原因。结果显示,HPV52型E6区的A125T、A294G 是新发现的突变,最常见的突变A379G(K93R)是非同义突变,其K93R与宫颈高级别病变有关[23-24],而E7区的T666C也是一个新发现的突变位点。HPV58型的E6、E7区均未发现新的突变位点,但是其突变的频率较高,16例发现突变位点,共发现11个核苷酸突变位点。其中HPV58型在E7区,非同义突变C632T(T20I)/G760A(G63S)会导致较高风险患CC[25]。HPV基因突变序列有地域性差异,本地区HPV52型突变序列均属于B2系,未发现A、C、D系,HPV58型基因序列均分布于A系,亦有研究表明,与A系相比,B系会增加罹患CC的风险[26]。因此,本地区HPV52和HPV58型导致CC风险较高,可能与本地区HPV52、HPV58 E6/E7区单核苷酸突变有关。

本研究HPV52、HPV58型基因测序样本量少,虽不能完全代表本地区SNP与流行株的谱系分布,但能一定程度上体现本地区HPV基因多态性,后续研究中还需要收集大量样本进行测序,为本地区的HPV感染防治和CC的预防提供帮助。