龙晓雪 刘 丹 李华婷 方启晨 贾伟平

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)指存在至少5%的肝脂肪变性，且除外引起继发性肝脂肪堆积的病因，如过量饮酒、慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、先天性肝病或长期使用引起脂肪变性的药物等[1]。NAFLD包括单纯性非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，以及进展而来的肝纤维化和肝硬化。NAFLD常与肥胖、2型糖尿病、高脂血症、高血压等疾病并发，是代谢综合征的表现之一。随着人们生活方式的改变，NAFLD患者数量约占全球总人数的1/4，且其患病率逐年增高，已成为世界范围内最常见的慢性肝脏疾病。NAFLD的具体发病机制目前尚未明确，早期理论为“二次打击”学说，认为不良的生活方式、高脂饮食、胰岛素抵抗等因素均可导致脂肪在肝细胞内堆积，并在此基础上发生氧化应激，诱导肝脏实质细胞发生炎症反应[2]。随着对NAFLD发病机制研究的深入，“二次打击”学说已拓展为“多重打击”学说，即胰岛素抵抗、脂肪组织分泌因子、营养因素、肠道微生物群，以及遗传和表观遗传等多种因素共同促进肝脏脂肪变性和炎症的发生[3]。肠道菌群是NAFLD发病机制研究的一个新兴方向，与其相关的研究逐年增多，以期明确其在NAFLD发生、发展中的作用，寻找新的干预靶点。

1 肠道菌群概述

肠道中存在数以万亿计的微生物，种类超过千种，包括细菌、古细菌、真菌、原生生物、病毒等构成一个相对稳定的生态系统。其中细菌占较高比例，是研究最多的肠道微生物。人体肠道菌群主要包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门四大类。从胎儿时期开始，人体肠道便有菌群定植，能帮助人体分解难以消化吸收的物质，也能通过代谢产物影响人体，与人体共同演化。在遗传背景、年龄、饮食、药物、昼夜节律、活动等因素影响下，肠道菌群处于动态平衡。在疾病状态下，人体可能发生肠道菌群紊乱。关于代谢疾病的研究发现，拟杆菌门/厚壁菌门比值失衡与代谢疾病的发生密切相关。肠道菌群的多样性是评价肠道微生态稳定性的指标，代谢疾病患者的肠道菌群多样性明显降低。

2 NAFLD与肠道菌群的变化相关

肠道与肝脏在生理结构及功能方面存在密切联系，肠道吸收的物质经门静脉首先流向肝脏，肝脏除代谢肠道来源的物质外，还可分泌胆汁直接影响肠道环境。这种相互作用是肠-肝轴的生理基础，使得肠道菌群的变化与肝脏疾病的发生密切相关。

除了拟杆菌门/厚壁菌门比值失衡及菌群多样性降低外，有研究发现，NAFLD患者肠道菌群中大肠埃希菌属、乳酸杆菌属及拟杆菌属丰度明显升高[4-5]，而粪球菌属、粪杆菌属、瘤胃球菌属丰度明显降低[5]。此外，不同严重程度的NAFLD患者之间肠道菌群的种类、相对丰度均存在差异；如与轻度NAFLD患者相比，进展期NAFLD患者肠道菌群中大肠埃希菌属及拟杆菌属丰度进一步升高[5]，提示在NAFLD进展过程中肠道菌群处于动态变化过程。

由于肠道菌群与人体相互影响、相互作用，研究者通过对无菌小鼠进行实验，探讨NAFLD患者中存在的肠道菌群紊乱是疾病导致的结果，还是促成疾病发生的原因。在体内无肠道菌群的情况下，高脂喂养的小鼠无脂肪肝形成，而将有脂肪肝的小鼠的粪便菌群或从中分离出的菌株移植给小鼠，可成功诱导其脂肪肝形成[6-8]。不仅如此，将肠道内发挥作用且难以吸收的抗生素予小鼠灌胃，可改善其脂肪肝的程度。上述研究结果提示，肠道菌群紊乱并非简单地继发于NAFLD，而是可能促进了NAFLD的发生和发展。

3 肠道菌群在NAFLD中可能的作用机制

目前的研究结果表明，肠道菌群主要通过影响肠道屏障功能、分泌内毒素、产生短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)、影响胆汁酸谱、代谢食物中的胆碱等机制影响NAFLD的发生和发展。

3.1 肠道屏障 肠道是直接与外环境接触的器官，在吸收营养成分的同时也要抵抗有害物质入侵，肠道细胞间的紧密连接、肠细胞分泌的黏液和定植肠道的微生物等共同构成了机体的保护屏障。肠道通透性的程度反映了肠道屏障功能的好坏。一项meta分析[9]的结果显示，与对照组相比，NAFLD组患者的肠道通透性增加，且肠道通透性与脂肪肝的严重程度相关。肠上皮细胞间的紧密连接是肠道物理屏障最重要的影响因素，在相同饮食诱导下，紧密连接蛋白缺乏的小鼠比野生型小鼠更易发生NAFLD[10]；该结果表明，肠道屏障功能对NAFLD的发生至关重要。而定植肠道的菌群能直接影响肠道屏障功能。Mouries等[11]将高脂饮食小鼠的粪便菌群移植至普通饮食小鼠，结果显示，接受菌群移植的普通饮食小鼠肠道屏障受损。在此基础上，大量肠道物质如细菌、内源性乙醇、细菌内毒素、胆汁酸等可经门静脉进入肝脏，引发NAFLD。

3.2 内源性乙醇 NASH与酒精性脂肪肝炎的病理表现极为相似，提示两者存在共同的发病机制。进一步研究证实，未摄入酒精的NAFLD患者血液中乙醇含量仍显着高于健康对照人群。Zhu等[12]通过对NAFLD患者的肠道菌群成分和血液中乙醇含量进行分析，推测大肠埃希菌可能通过促进肠道内乙醇含量的增加而引发AFLD。除大肠埃希菌外，肠道内很多菌群(如肺炎克雷伯菌、发酵乳杆菌等)具有将食物残渣代谢为乙醇的能力。Yuan等[7]将从NAFLD患者的粪便中分离出高产乙醇的细菌，灌胃给无特定病原体(specefic pathogen free, SPF)小鼠或无菌小鼠，均能引起脂肪肝。过多的内源性乙醇能破坏肠道屏障结构，增加肠道通透性，促进肠内有害物质进入肝脏；同时，其在进入肝脏后可阻碍脂质代谢，并在肝脏氧化酶氧化过程中产生氧自由基，从而加重肝脏的炎症程度[13]。

3.3 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要组成成分，由O抗原、核心多糖和类脂A构成，在人体能诱发固有免疫反应。肠道中菌群来源的LPS通过激活肠壁免疫反应损伤肠道屏障。NAFLD患者循环LPS水平升高，且与疾病严重程度呈正相关。循环LPS导致的慢性低度炎症可导致肥胖和胰岛素抵抗发生，进而导致肝脏细胞脂质沉积。不同细菌来源的LPS毒力不同，毒力越大者的NAFLD致病能力越强[8]。LPS在体内与循环中的LPS结合蛋白(LBP)结合后，在抗原分化簇14(cluster of differentiation 14，CD14)的辅助下，主要由细胞膜上Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)特异性识别并激活下游信号分子。TLR4在肝实质细胞和间质细胞上均有表达。LPS通过下游NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase，JNK)信号通路[14]激活肝脏库普弗细胞和肝星状细胞，释放出一系列前炎症因子如IL-1、IL-6及TNF，导致肝细胞脂质沉积和炎症反应的发生[15]。研究[16]结果表明，LPS还可通过促进肝星状细胞内的脂滴自噬，增强肝星状细胞对TNF-β的敏感性，从而诱导肝纤维化发生。

3.4 胆汁酸 胆汁酸是胆固醇在肝细胞中的代谢产物，是胆汁的主要组成成分，促进脂质及脂溶性维生素的吸收。胆汁酸可直接发挥抑菌作用，或者通过激活其主要受体——法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)产生抑菌肽，防止肠道细菌过度生长；此外，胆汁酸也受菌群调控。肝脏合成并分泌的初级胆汁酸，如胆酸(cholic acid，CA)、鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)及其与甘氨酸或牛磺酸的结合物，在肠道内可被肠道菌群代谢为次级胆汁酸，包括脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)、石胆酸(lithocholic acid，LCA)和熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)等，即肠道菌群可调节胆汁酸谱。CDCA可通过刺激FXR提高胰岛素敏感性，降低肝脏糖异生和循环TG水平，而DCA则抑制FXR。当肠道菌群紊乱时，胆汁酸谱发生变化，刺激FXR的胆汁酸减少而抑制FXR的胆汁酸增多，使得肝脏脂质合成增加[17-18]。肠道菌群调控的牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid，TCDC)通过作用于迷走神经背核簇的FXR，可影响胰岛素敏感性[19]，这也是NAFLD发病机制的中心环节。因此，肠道菌群紊乱可能通过影响胆汁酸谱来促进NAFLD的发生。

3.5 SCFA SCFA是肠道菌群代谢复杂多糖产生的一类化合物，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸。其中主要成分是乙酸、丙酸及丁酸。大部分SCFA分子在肠道被利用，为肠上皮细胞提供能量，促进上皮细胞增殖和分化，从而起到保护肠道屏障的作用。少部分SCFA分子可通过转运蛋白进入门静脉，并进入肝脏参与三羧酸循环或者糖原、脂质的生成。因此，在饮食摄入量不变的条件下，产SCFA细菌的增多使得机体摄入的能量增加，消耗减少。研究[20]发现，果糖导致NAFLD发生的机制之一即在肠道菌群代谢作用下产生大量乙酸，成为肝脏脂质合成的原料。此外，SCFA可作为信号分子激活G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor，GPR)如GPR43、GPR41、GPR109a，以及直接抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)而发挥作用。丙酸激活肠道内分泌细胞的GPR43后可促进类胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)和酪酪肽(peptide YY，PYY)的分泌调节代谢[21]。SCFA直接抑制HDAC，通过表观遗传的变化上调脂质氧化基因的表达，促进肝脏脂质氧化[22]。然而，有研究[23]结果显示，NAFLD患者的粪便中SCFA水平明显升高，且与外周T细胞的活化水平呈正相关；关于SCFA是NAFLD发生的保护作用，还是其损伤因素仍需要更多的研究探讨。

3.6 胆碱及其相关代谢物 胆碱是人体必需的营养物质，其在人体主要用于磷酸化合成磷脂或者被氧化作为甲基供体继而参与多种生理过程。在脂质代谢中，胆碱合成的磷酸胆碱是极低密度脂蛋白(very low density lipoproteins，VLDL)的合成原料，胆碱缺乏可减少VLDL的合成和分泌，使肝细胞内的TG向外周转运障碍，导致肝内脂质沉积[24]。基于这一机制，缺胆碱饮食已广泛用于NAFLD小鼠的造模。人体所需的胆碱大部分从食物中获取，而多种肠道菌群在生长过程中需要利用胆碱合成生物膜。这些细菌的增多可能消耗食物中的胆碱使人体处于胆碱缺乏状态，从而导致NAFLD的发生[5]。

此外，饮食中的胆碱可被细菌代谢为三甲胺(trimethylamine，TMA)，并在进入肝脏后被氧化为氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)。有研究[17]结果显示，TMAO与NAFLD的严重程度呈正相关，其可能的机制是TMAO通过促进肝细胞中胆汁酸合成途径的关键酶CYP7A1(cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1)的表达；调节胆汁酸谱，使FXR刺激型胆汁酸水平降低，FXR抑制型胆汁酸水平增高；促进肝脏脂质合成，从而加重NAFLD。

4 以肠道菌群为靶点的干预措施

4.1 抗生素 鉴于肠道菌群紊乱可能促进NAFLD的发生、发展，有学者对抗生素是否具有治疗NAFLD的效果展开研究。利福昔明是衍生于利福霉素的口服抗生素，其在肠道中几乎不能被吸收，在胃肠道中具有广谱抗菌作用。小鼠口服利福昔明可抑制其肠道细菌过度生长，并降低内毒素水平，减少肝内脂质沉积[25]。在停用利福昔明后观察到有益菌(双歧杆菌、普拉梭菌和乳酸杆菌等)含量增加，提示利福昔明对调节肠道菌群组成具有积极的作用[26]。给予NASH患者利福昔明治疗后，患者肠道通透性降低，与ARB联合使用可以改善肝纤维化[27]。然而，长期使用抗生素可能会导致细菌耐药的发生，影响体内有益菌的生长，产生新的菌群紊乱。因此，应当谨慎使用抗生素治疗NAFLD。

4.2 益生菌及益生元 补充外源性益生菌或益生元是一种调节菌群的潜在方法。早期研究[28]发现，给予NAFLD患者微生物混合制剂VSL#8治疗后，可减少其肝脏氧化和炎症所致的损伤；随后的研究提示，鼠李糖乳杆菌GG(LGG)的分泌蛋白可促进肠道黏蛋白表达，预防LPS或TNF-α对肠道屏障造成损伤。给予青春双歧杆菌干预后，NASH模型小鼠的肠道屏障功能得以改善[29]。Lee等[30]研究提示，乳酸菌还可通过减少胆固醇和脂肪变性来延缓NAFLD的进展。除了活菌外，使用灭活的益生菌干预也被证明能调控代谢[31-32]。

益生元是指本身不能被人体消化吸收，但可被肠道中某些有益菌利用而发挥保护作用的物质。增加益生元的摄入可促进有益菌的生长，调节肠道菌群。复杂多糖被肠道菌群酵解后生成SCFA，作为肠道细胞的能量来源保护肠道屏障功能，甚至可调节肠道激素的释放和代谢。动物实验结果表明，益生元如菊粉、低聚糖、抗生淀粉等可改善高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性[33]。然而，益生元和益生菌制剂的研究也存在争议。在一项预防与抗生素相关营养不良和相关不良反应发生的研究[34]中，在接受抗生素治疗后，混合益生菌制剂干预者肠道功能的恢复速度远不如接受自身粪便菌群移植者。使用益生菌和益生元制剂治疗NAFLD的安全性和有效性仍需要更多的研究探索。

4.3 粪便菌群移植 粪便菌群移植已被广泛应用于动物模型研究中。动物实验证明，将普通饮食小鼠的粪便菌群移植至高脂喂养小鼠，小鼠肠道菌群紊乱得以纠正，且改善了肝脏脂质沉积和NAFLD活动度评分(NAFLD activity score，NAS)[35]。在一项针对代谢综合征受试者的粪便菌群移植临床试验中，试验组中将体型较瘦的健康受试者的粪便菌群移植给代谢综合征受试者，而对照组中的代谢综合征受试者则接受自体菌群移植；移植6周后，试验组受试者胰岛素敏感性较对照组显着改善[36]，但这种获益仍取决于受试者干预前的菌群状况。目前，在NAFLD患者中开展粪便菌群移植的临床试验不多，一项针对21例NAFLD受试者的菌群移植试验结果显示，移植健康受试者的粪便菌群可改善NAFLD患者的肠道通透性，但随访6个月未见胰岛素敏感性增加或肝内脂质含量降低[37]。由于目前研究有限，不能确定粪便菌群移植试验是否有效，尚需进行更多高质量的随机、双盲临床研究。

4.4 中药治疗 在肠道菌群的研究中发现，中药(如黄连素、槲皮素、白藜芦醇等)可调节肠道菌群紊乱。一些复方汤剂如茵陈蒿汤也具有调节NAFLD肠道菌群，增加菌群多样性，改善肝脏代谢功能的作用[38]。上述中药具有良好的安全性，未来或许可作为治疗NAFLD的备选药物。

5 展 望

随着方法学的发展，关于人体肠道菌群的检测已从最开始的培养法，经过实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)、16SRNA测序发展至基于二代测序的宏基因组测序，对菌群分类逐渐细化。此外，转录组学、蛋白质组学和代谢组学的多组学联合研究使得肠道菌群的研究从探讨菌群成分拓展至菌群功能，并从整体上揭示菌群对于人体代谢、免疫的调节作用。动物实验和人群研究已充分证实，肠道菌群在NAFLD的发生、发展中具有重要作用，并且可能成为新的治疗靶点，但研究尚处于初期阶段。首先，相对人体肠道菌群而言，利用现有公共数据库和研究方法所能检测到的细菌仍很少，还需进一步革新研究手段，并联合多种科研力量来扩大公共数据库。其次，大量关于肠道菌群的研究基于粪便中的细菌，其与肠道细菌的一致性存疑，且不同肠段的定植菌也不一致[39]，研究者已开发出在肠道内可视化采样的胶囊内镜[40]，未来关于肠道菌群的研究不仅要聚焦于菌群丰度和组成，还需结合菌群在肠道中的空间分布。同时，在分析肠道菌群与疾病发生或改善的关系时，关联研究不能代替因果关系研究，必须使用从患者或干预后获得改善的受试者肠道内容物中分离得到的细菌进行干预，以验证该细菌与疾病发生或改善的因果关系[41]。最后，找到关键功能菌，将其作为治疗靶点进行临床转化是NAFLD肠道菌群研究的最终目的，以肠道细菌为靶点的干预手段已在一些动物实验中初见成效，但临床研究仍较少，安全性和有效性有待验证；此外，当单纯性脂肪肝进展为NASH及肝硬化时，这些治疗方法能否延缓疾病进程，更是需要大量动物实验和临床试验进行探索。

随着NAFLD更名为代谢性脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)[42]，该类疾病被重新定义为肝脏组织学、影像学或血液生物标志物检查提示存在脂肪肝，同时合并超重或肥胖、2型糖尿病、代谢功能障碍等任一状态[43]，以肯定性诊断代替繁琐的排他性诊断，强调代谢紊乱的重要地位而弱化病因。上述变化对现有肠道菌群与NAFLD发生、发展的相关性研究是否有影响尚未可知，今后还需在MAFLD的研究中继续探讨肠道菌群所扮演的角色。