郭艳萍， 卢圣玉， 许志国， 曹 娜， 孙鹏杰， 侯 健

(太原工业学院环境与安全工程系，山西 太原 030008)

引 言

葡萄酵素是以葡萄为原料，经过多菌种复合型微生物群体发酵制得的可食用的液态发酵产品[1]。研究表明，天然酵素因其含有丰富的有机酸、功效酶、维生素和矿物质而具有较强的抗氧化性能[2]，可美容养颜、抑菌消炎、提高免疫力[3]。黑鸡心葡萄是山西特有葡萄品种之一[4]，色泽黑紫，果粒密实，形似鸡心，但其口感偏涩，种植率大幅度降低，需改变其食用方式，达到保种目的，制成酵素后口感改善，种植率缓慢提升。

本研究对天然发酵生产的黑鸡心葡萄酵素的总酚含量、还原力、DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基和超氧自由基清除率进行了测定,旨在为黑鸡心葡萄天然酵素的生产工艺改良提供一定的理论依据和数据支持。

1 实验部分

1.1 实验仪器

pH仪、电子天平、752N型紫外可见分光光度计、TGL-16G-C高速冷冻离心机、SW-C1-IPD-Z型洁净工作台、电热恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 酵素的制备[5]

冰糖紫外杀菌30 min，与葡萄按质量比1∶1加入到已灭菌的玻璃瓶中，封口，常温下发酵。发酵过程中，每6 d为一阶段取样，样品10 000 r/min离心10 min后，用于测定。

1.2.2 总酚含量测定[6]

以没食子酸等价物表示，按照标准曲线线性方程y=0.092 0x+0.020 8，R2=0.999 9测定总酚含量，y为吸光度，x为样品浓度(GAE,μg)。样品100 μL、去离子水45.9 mL，Folin-Ciocalteau试剂1 mL，反应5 min，最后，加入20%的Na2CO3溶液3 mL，以去离子水为参比于760 nm波长下测吸光度。

1.2.3 DPPH·清除率

40 μL酵素样品加入到4 mL 0.1 mmol/L DPPH自由基溶液中，再加Tris-Hcl buffer(50 mmol/L,pH=7.4)450 μL，25 ℃振荡混匀后于517 nm波长下测吸光度。

1.2.4 ABTS自由基清除能力[7]

10 μL酵素样品加入到5 mL ABTS母液中，30 ℃水浴5 min后于734 nm下测定吸光度。

1.2.5 ·OH清除能力

水杨酸法[7]：酵素样品135 μL加入到1.4 mL H2O2(6 mmol/L)，再加入2 mL硫酸亚铁(1.5 mmol/L)和0.6 mL水杨酸钠(20 mmol/L)，25 ℃水浴1 h后于562 nm下测定吸光度，其清除率计算见式(1)。

清除率(%)=[1-(A562-Ai)/Ac]×100

(1)

式中：Ac为空白对照的吸光度值。

邻苯三酚法[8]反应体系：50 μL样品、950 μL磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH=7.4)，1 mL NADH、1 mL NBT、1 mL PMS。25 ℃恒温反应5 min后于560 nm下测吸光度。

1.2.7 还原力测定

普鲁士蓝法[9]。反应体系：30 μL样品，2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH=6.6)，2.5 mL 1%铁氰化钾，50 ℃反应30 min，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，4 000 r/min下离心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%三氯化铁。700 nm下测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 葡萄酵素总酚含量的测定

由图1可看出，葡萄酵素在发酵初期0 d～12 d总酚含量缓慢上升，12 d～18 d含量有较大降幅，之后，总酚含量呈逐步上升趋势，至36 d总酚含量达到最大值2.850 mg/mL，之后趋于平稳。酚类物质含量随着发酵过程中有益生菌的增加而增多，当菌群达到稳定期时酚类物质溶出速率平稳。

图1 发酵过程中总酚含量的变化

2.2 葡萄酵素对DPPH·清除能力

由图2可看出，葡萄酵素对DPPH·的清除能力展示出与发酵过程中总酚含量(图1)变化趋势一致，但变化幅度较小。清除能力总体较强，峰值出现在第30 d，清除率达到93.25%，较初始增加了6.80%。葡萄酵素对自由基的清除率主要原于发酵过程中酚类物质的溶出，展现出较强的抗氧化活性。

图2 发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化

2.3 葡萄酵素对超氧自由基清除能力

图3 发酵过程中超氧自由基清除能力的变化

2.4 葡萄酵素对羟基自由基(·OH)清除能力

·OH是生物体内最活泼的自由基，毒性强、高损伤性，可损伤细胞膜，轻易地进入各种细胞中，导致疾病发生。

图4显示，葡萄酵素对·OH的清除能力相对于其他自由基的清除能力较低，比未发酵时增加了4.13%。发酵初期，葡萄酵素对·OH的清除能力呈大幅减弱，之后缓慢回升，在42 d时达到62.16%。

图4 发酵过程中羟基自由基清除能力的变化

2.5 葡萄酵素对ABTS自由基清除能力

图5显示，发酵过程中葡萄酵素对ABTS自由基的清除能力呈小幅波浪形变化，但整体清除率较高，发酵30 d时出现最大值88.20%，增幅13%左右。

图5 发酵过程中ABTS自由基清除能力的变化

2.6 葡萄酵素发酵过程中还原力的变化

第3页图6显示，葡萄酵素在发酵过程中还原力变化波动较大，初期持续上升而后骤降，24 d达到最低值后缓慢回升。18 d时达到峰值，发酵前、后还原力增加了80.41%。总体呈上升趋势，说明酵素在发酵过程中抗氧化成分是有所增加的。

3 结论

研究结果表明，以山西黑鸡心葡萄为原料，经过多种微生物复合发酵制得的黑鸡心葡萄酵素抗氧化性能较强，发酵生产30 d的酵素抗氧化能力最强。发酵过程中自由基清除能力均呈逐渐增加趋势，发酵

图6 发酵过程中还原力的变化

前、后分别提高了6.84%和6.80%、4.13%和13%。还原力变化虽不规则，但总体呈上升趋势。研究发现，黑鸡心葡萄天然酵素对4种自由基的清除能力与总酚含量的变化呈相同趋势，具有一定相关性。本研究结果为黑鸡心葡萄酵素的工艺改良提供一定的理论依据和数据支持。