霍 莹,郑辑英,李光来,薛国芳,牛海雁
癫痫持续状态(SE)是神经科的急症,临床和动物实验都证实,SE会导致认知、行为的改变,严重时会直接导致死亡。研究表明,SE后引起的细胞凋亡是痫性脑损伤的重要环节之一。因此,抑制细胞凋亡的发生,对防治SE导致的脑组织损伤具有重要的临床意义。长托宁是一种新型的脑保护剂,有报道显示[1],长托宁可以减轻缺血/再灌注时脑组织损伤,起到脑保护作用。但长托宁对SE导致的脑损伤是否有保护作用尚未见研究报道。本实验旨在观察SE后大鼠脑组织凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2的表达情况,探讨长托宁干预对SE导致的神经元损伤的影响及其可能机制,以期为长托宁应用于临床SE的治疗提供可能的动物实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠54只,体重180 g～220 g,由山西医科大学生理教研室动物中心提供;氯化锂购自中国医药集团上海试剂公司;匹罗卡品购自美国Sigma公司;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗体、TUNEL试剂盒、即用型SABC试剂盒均系武汉博士德公司产品;DAB试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司出品;长托宁系成都力思特制药股份有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 54只Wistar大鼠随机分为A组(对照组)6只,B组(模型组)和C组(长托宁组)各24只,后两组按时间点分为4个亚组(6 h,12 h,24 h,48 h)。
1.2.2 动物模型制备 C组在造模前15 min腹腔注射长托宁2 mg/kg,24 h和 48 h亚组每12 h重复1次,剂量同前。A组、B组于相对应时间给予等量生理盐水。15 min后B组、C组腹腔注射氯化锂127 mg/kg,18 h后再注射新鲜配制的匹罗卡品30 mg/kg制备SE模型;A组腹腔注射等量的生理盐水。观察大鼠出现痫性发作的时间和表现,使之持续1 h,然后腹腔注射地西泮10 mg/kg以终止痫性发作。惊厥评分采用Racine评分法,出现3级以上发作提示造模成功,造模过程中大鼠出现死亡或不符合模型要求者,予以剔除并随机补充,以保证每组动物6只。
1.2.3 标本处理 在SE后相应时间点各取大鼠6只,用25%乌拉坦4 mL/kg深麻醉后,断头取脑,大鼠脑组织置入4%多聚甲醛中固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋后,在视交叉后海马区连续冠状切片,片厚 5 μ m,每隔15张连续取 4张,相邻切片分为四套,分别进行各指标的检测。HE染色,光镜下观察形态学变化。
1.2.4 细胞凋亡检测 采用T UNEL法检测,按试剂盒(POD)提供的方法进行操作,细胞核中有棕黄色颗粒者即为阳性细胞,即凋亡细胞。
1.2.5 Caspase-3及Bcl-2蛋白免疫组化检测 免疫组化步骤参照试剂盒推荐方法进行(常规SABC法,DAB染色)。胞浆或核膜染色呈棕黄色为蛋白阳性表达。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计分析软件,两组间的比较采用t检验,多组间的比较采用方差分析,检测结果以均数±标准差(±s)表示。
2 结 果
2.1 行为学表现 B组大鼠注射匹罗卡品后15 min～30 min均出现流涎、点头、洗脸样动作;随后出现前肢阵挛,之后很快表现为前肢阵挛伴站立,进一步发展到全身强直阵挛发作伴站立、摔倒,反复发作,均达到Ⅳ级～Ⅴ级发作,呈癫痫持续状态,点燃率为100%;C组大鼠也均达到癫痫持续状态,但潜伏期较长且痫性发作程度较B组轻,多在Ⅲ级～ Ⅳ级发作;A组大鼠无癫痫发作。
2.2 HE染色结果 A组神经元排列整齐紧密,胞浆透明,细胞核呈圆形或椭圆形,染色质分布均匀,核仁清晰;B组出现了嗜酸性神经元,表现为细胞排列紊乱,胞体收缩呈三角形或极不规则,胞浆红染、胞核明显固缩;C组也出现嗜酸性神经元,但排列尚整齐,形态接近正常。
2.3 细胞凋亡检测 A组仅有少量TUNEL阳性细胞表达,呈散在分布,着色较浅;B组6 h时TUNEL阳性细胞表达开始增多,并随时间点的延长而增加,24 h达高峰,48 h减少,与B组相比,C组TUNEL阳性细胞仍在24 h达高峰,但相应时间点TUNEL阳性细胞的表达均低于B组,差异有统计学意义(除6 h外,P＜0.05)。详见表1。
表1 各组大鼠海马T UNEL阳性细胞数比较(±s)个
表1 各组大鼠海马T UNEL阳性细胞数比较(±s)个
组别 6 h 12 h 24 h 48 h A组 2.09±0.33 B组 14.71±1.431) 28.33±1.731)36.16±1.831) 27.46±1.451)C组 13.38±1.41 18.53±1.292)27.58±1.422) 19.41±1.392)与A组比较,1)P＜0.05;与B组比较,2)P＜0.05
2.4 Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达 A组可有Bcl-2、Caspase-3微量的基础表达;B组与 A组比较,6 h时 Bcl-2和Caspase-3表达开始增强(P＜0.05),12h时,Bcl-2达高峰(P＜0.05),Caspase-3显着增强(P＜0.05);24 h Bcl-2开始减弱(P＜0.05),Caspase-3达峰值(P＜0.05),48 h二者均继续减弱(P＜0.05)。C组与B组比较,除 6 h外,各时点 Bcl-2和Caspase-3表达差异均有统计学意义(P＜0.05)。详见表 2、表3。
表2 各组大鼠海马Bcl-2免疫反应阳性细胞数(±s)个
表2 各组大鼠海马Bcl-2免疫反应阳性细胞数(±s)个
组别 6 h 12 h 24 h 48 h A 组 10.35±1.08 B组 25.34±1.251) 39.94±1.751)33.09±2.051) 25.69±1.501)C组 26.56±1.49 50.18±1.742)46.46±2.832) 41.56±1.392)与A组比较,1)P＜0.05;与B组比较,2)P＜0.05
表3 各组大鼠海马Caspase-3免疫反应阳性细胞数(±s)个
表3 各组大鼠海马Caspase-3免疫反应阳性细胞数(±s)个
组别 6 h 12 h 24 h 48 h A组 1.70±0.29 B组 10.23±1.491) 18.45±1.501)30.87±2.501) 24.27±1.841)C组 9.44±1.35 12.33±1.402)18.42±1.592) 15.67±1.392)与A组比较,1)P＜0.05;与B组比较,2)P＜0.05
3 讨 论
SE后神经元的损伤机制一直是近年来的研究热点,形态学和生化的方法均证实,SE后神经元死亡具有典型的凋亡特征。Bcl-2和Caspases蛋白家族是最主要的凋亡调控基因。Bcl-2是第一个被认为可以抑制细胞凋亡的基因,它可以阻止细胞凋亡的发生,延长细胞生存,被称为细胞长寿基因[2]。氯化锂-匹罗卡品诱发SE后Bcl-2表达异常,证实Bcl-2参与了SE后神经元损伤的调控[3]。随着对凋亡研究的深入,Caspase-3越来越引起人们的关注。细胞凋亡过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程,Caspase-3是Caspase级联反应中下游最关键的凋亡执行蛋白酶,在凋亡程序中起最后枢纽作用[4]。有研究发现[5],6周龄的SD大鼠,在腹腔注射匹罗卡品出现SE后1 h处死,免疫阳性Caspase-3陡然升高(与对照组相比),证实Caspase-3在癫痫引起的神经元凋亡机制中确实发挥了重要的作用。本实验研究结果显示,A组仅有Bcl-2、Caspase-3基础量的表达,B组Bcl-2于SE后6h升高,12 h达高峰,48 h减少;而Caspase-3在SE后6 h升高,24 h达峰值,这与TUNEL阳性细胞的表达基本一致,进一步证明Bcl-2抑制神经细胞凋亡,而Caspase-3促进细胞凋亡。C组各时间点TUNEL、Caspase-3阳性细胞较B组减少(除6 h外均 P＜0.05),而Bcl-2阳性细胞数增加(除 6 h外均 P＜0.05),表明长托宁能够通过上调 Bcl-2、下调Caspase-3,从而产生抗细胞凋亡作用。
近年来,抗胆碱能药物作为一种新型的脑保护剂越来越得到人们的关注。有研究表明[6],抗胆碱能药物可以通过稳定细胞膜、抗氧自由基损伤、减少钙超载、抑制兴奋性氨基酸释放、抑制一氧化氮(NO)释放、促进热休克蛋白70(HSP70)表达等方式,从而发挥对神经元的保护作用。长托宁(盐酸戊乙奎醚注射液)是一种新型的抗胆碱药物,具有抗胆碱作用强而全面,副反应少,半衰期长,易通过血脑屏障的特点,临床和动物实验均证实长托宁具有较强的脑细胞保护作用。本实验研究表明,预先给予长托宁能延迟SE出现的时间,并减轻癫痫发作级别以及神经元的损伤程度,长托宁可能通过上调SE时大鼠脑组织Bcl-2的表达和抑制Caspase-3产生,从而发挥神经元保护作用。长托宁的脑保护机制是多途径、多位点的,笔者将做进一步探讨。
[1]曹锋生,韩继媛,田兆兴.长托宁对大鼠急性全脑缺血再灌注后NF-κ B的影响[J].岭南急诊医学杂志,2006,11(1):7-9.
[2]Konturek PC,Konturek SJ,Sulekova Z,et al.Expression of hepatocyte growth factor,transforming growth fact or alpha,apoptosis related proteins bax and bcl-2,and gastrin in human gastric cancer[J].Aliment Pharma col T her,2001,15:989-999.
[3]岳宏,郑辑英、李光来,等.塞来昔布对大鼠癫痫持续状态海马神经元凋亡及Bcl-2表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2008,6(4):436-438.
[4]Zhu C,Wang X,Xu F,et al.The influence of age on apoptotic and other mechanisms of cell death after cerebral hypoxia-ischemia[J].Cell Death Differ,2005:12(2):162-176.
[5]温晓妮.促红细胞生成素预处理对锂-匹罗卡品诱导的癫痫持续状态大鼠海马神经元凋亡的影响[J].陕西医学杂志,2008,8(37):954-956.
[6]曹锋生,韩继媛.抗胆碱能药防治缺血再灌注损伤的研究进展[J].医药导报,2006,25(9):931-933.
