刘飞君,宋二飞,武冬梅,张轩萍,刘 宇,梁月琴,张明升

KB-R7943是一种特异性钠钙交换(Na+/Ca2+exchange,NCE)抑制剂。在双向离子环境下,KB-R7943对心肌细胞NCE具有双向抑制作用[1],既能抑制反向 NCE(即Na+出Ca2+入),又能抑制正向 NCE(即 Na+入Ca2+出)。KB-R7943广泛应用于心血管疾病的研究和治疗,尤其对高盐饮食诱导的高血压模型治疗效果显着[2],同时通过减轻Ca2+超载,KB-R7943对缺血/再灌注过程中心肌组织的损伤具有保护作用[3,4]。在高糖引起的大鼠离体胸主动脉内皮损伤模型中,KB-R7943能够恢复损伤的内皮依赖的舒张功能[5]。但是关于KB-R7943对成年大鼠离体血管环的直接作用未见报道,本实验将采用离体血管张力记录实验方法,观察KB-R7943对成年大鼠离体血管反应性的影响,并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 KB-R7943购自英国TOCRIS公司;左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(Indomethacin)、苯肾上腺素(PE)、5-羟色胺(5-HT)、血栓素A2类似物(U-46619)、乙酰胆碱(Ach)均购自 Sigma公司;硝普钠(SNP)购自丹东医创药业有限责任公司。其余试剂为市售优级纯。

1.2 大鼠肾动脉血管环标本的制备 SD雄性大鼠,体重为200 g～300 g,由山西医科大学实验动物中心提供。大鼠断头处死后,立即取出肾脏、大脑、心脏和胸主动脉,置于氧饱和的4℃PSS液中。腹主动脉环的制备:腹主动脉剪成长度约4 mm的血管环,连于张力换能器,使用Powerlab生物信号测定系统(澳大利亚埃德)记录血管环张力变化。肾动脉环的制备:用大头针分别固定肾脏的两端,沿肾动脉剥离动脉的三级分支,剪取2 mm左右的血管环。大脑中动脉环的制备:钝性分离颈内动脉的延续—大脑中动脉,在靠近内侧处剪取2 mm左右的血管环。冠状动脉血管环的制备:钝性分离冠状动脉,在前降支处剪取2 mm的血管环。将分离干净的动脉环固定在Multi Myograph System-610M(DMT,丹麦)浴槽内传感器上,持续通以100%O2,浴槽温度恒定在37℃,张力的变化通过DMT的换能系统采集。在开始正式实验之前,用60 mmol/L的KCl预收缩,当收缩达稳定的平台时用Ach(10-5mol/L)舒张,连续3次,当相邻两次刺激的收缩幅度或舒张幅度差别不大于10%,认为血管环组织结构完整,功能正常,然后开始正式实验。

1.3 KB-R7943对大鼠肾动脉环张力的影响 基础张力状态下实验组累积加入 10-8mol/L～10-6mol/L的 KB-R7943;空白对照组累积加入相同浓度的NaCl,以排除渗透压增大对实验结果的影响。以实验组每次加药后血管张力达坪值后,才开始加下一个浓度。

1.4 KB-R7943对大鼠离体各器官动脉环的舒张作用 动脉环稳定30 min后,用60 mmol/L KCl所致血管预收缩达到坪值时累积加入 10-8mol/L～10-6mol/L的 KB-R7943或SNP,观察其舒张作用。以 60 mmol/L KC1所致的最大收缩张力为100%,然后分别计算出各浓度药物所致舒张的百分比,最后做出药物的浓度-舒张效应曲线。

1.5 L-NAME和Indomethacin对KB-R7943舒张肾动脉环作用的影响 60 mmol/L KCl预收缩肾动脉环,待收缩达坪值后,分别加入一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(10-4mol/L),环氧合酶抑制剂Indomethacin(10-5mol/L),当血管环收缩再次达到坪值后。实验组和对照组累积加入KB-R7943(10-8mol/L～10-6mol/L)。

1.6 KB-R7943对肾动脉环 PE、U-46619、5-HT浓度-效应曲线的影响 肾动脉环稳定30 min后,向各浴管中分别累PE(3×10-8mol/L～10-5mol/L),U-46619(10-7mol/L～10-5mol/L),5-HT(10-8mol/L～ 10-6mol/L),以PE、U-46619、5-HT最大收缩幅度为100%,构建 PE、U-46619、5-HT浓度-收缩效应曲线。用正常PSS液冲洗标本3次,使标本充分休息恢复,向浴管内分别加入KB-R7943,使浴管内终浓度分别为10-6mol/L、3×10-6mol/L或 10-5mol/L,孵 育 30 min,然后 在不同浓度药物存在的基础上依次重建PE、U-46619、5-HT浓度-效应曲线,观察 KB-R7943预干预对 PE、U-46619、5-HT浓度-收缩效应曲线的影响。

1.7 统计学处理 应用SPSS 13.0作统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验。为比较药物作用强度,用Logistic法将量效关系曲线直线化,求出使预收缩张力舒张50%所需的浓度(RC50),或使刺激剂最大效应下降50%所需的浓度(IC50)。

2 结 果

2.1 在基础状态下,KB-R7943对大鼠动脉环张力的影响KB-R7943各浓度组对大鼠各器官血管环及主动脉环的基础张力无明显影响,与对照组比较差异无统计学意义P＞0.05)。

2.2 KB-R7943对离体肾动脉环的舒张作用(见图1)KCl(60 mmol/L)使成年大鼠主动脉、肾动脉、大脑中动脉和冠脉环持续收缩,最大收缩幅度分别为(2.85±0.47)g,(4.95±0.69)mN,(3.39±0.77)mN和(4.96±1.21)mN。KB-R7943(10-8mol/L～10-6mol/L)和 SNP(10-8mol/L～10-6mol/L)对 KCl(60 mmol/L)预收缩的大鼠各器官血管环均有浓度依赖性舒张作用,最大舒张率分别为(43.86±6.83)%和(58.76±9.44)%、(87.08±1.83)%和(60.97±2.43)%、(59.86±4.83)%和(46.81±2.43)%、(54.74±7.45)%和(66.27±3.23)%。其 EC50分 别为3.78×10-7mol/L和1.44×10-7mol/L、1.80×10-7mol/L和6.87×10-8mol/L、7.27×10-7mol/L和 3.12×10-7mol/L、2.66×10-6mol/L和 7.04×10-8mol/L。

图1 KB-R7943对离体肾动脉环的舒张作用

2.3 L-NAM E和Indo对KB-R7943舒血管作用的影响(见图2)在KCl预收缩的内皮完整的肾动脉环上,L-NAM E能够减弱KB-R7943(10-8mol/L～3×10-7mol/L)舒张肾血管环的作用,对KB-R7943(10-6mol/L)舒血管作用没有显着影响。环氧合酶抑制剂Indo对KB-R7943的舒血管作用均没有明显影响。

图2 L-NAM E和Indo对KB-R7943舒血管作用的影响

2.4 KB-R7943对PE、5-HT、U-46619浓度-效应曲线的影响(见图3)KB-R7943 10-6mol/L、3×10-6mol/L或10-5mol/L均可以使PE、U-46619、5-HT的收缩量效曲线非平行右移,并抑制最大反应。PE、5-HT、U-46619的最大收缩幅度随KBR7943浓度的增加分别下降了(54.44±3.82)%,(63.33±3.82)%和(38.01±9.82)%。

图3 KB-R7943对PE、5-HT、U-46619浓度-效应曲线的影响

3 讨 论

KB-R7943是第一个具有相对选择性的,有效的钠钙交换抑制剂,被作为药理学实验的重要工具药物。在心血管疾病的治疗方面也有广泛应用,对缺血再灌注过程中心肌组织的损伤和 洋地黄引起的心律失常具有保护作用[6]。但是,关于KB-R7943本身对于离体血管环作用的报道非常少见,本实验采用离体血管体外实验的方法,观察了KB-R7943对高钾去极化引起的成年大鼠主动脉和其他小血管(肾动脉、大脑中动脉和冠脉)预收缩的舒张作用,并与内皮非依赖性血管舒张药SNP进行了比较。结果表明,他们在(10-8mol/L～10-6mol/L)浓度范围内对高钾引起的预收缩均表现出浓度依赖性的舒张效应。在主动脉和冠脉KB-R7943的舒张作用弱于SNP,在肾动脉和大脑中动脉,低浓度的KB-R7943(10-8mol/L、3×10-8mol/L)舒张作用弱于SNP,而高浓度的KB-R7943(10-6mol/L)舒张作用强于 SNP。还观察了预先给予KB-R7943(10-6mol/L、3×10-6mol/L或10-5mol/L)对PE、5-HT、U-46619引起的大鼠肾动脉环收缩的浓度-收缩效应曲线的影响,结果表明,KB-R7943浓度依赖性的使 PE、5-HT、U-46619的浓度-收缩效应曲线非平行性右移,并抑制最大反应,使最大抑制效应下降。提示了KB-R7943能够抑制多种致痉剂对肾动脉血管环的收缩作用,对各种致痉剂无明显的选择性。

血管的内皮细胞通过释放NO、前列环素(PGI2)等血管舒张物质调节血管平滑肌的张力[7]。Ying等[5]发现KB-R7943预处理能够使高糖损伤的大鼠主动脉氧自由基的产生减少,同时使超氧化物歧化酶(SOD)的活性和NO的含量增加。KB-R7943的血管保护作用能够被一氧化氮合酶抑制剂L-NAME所逆转。本实验结果显示,NO合酶抑制剂L-NAME能够显着抑制KB-R7943对内皮完整的肾动脉环的舒张作用,但未能阻断高浓度KB-R7943(10-5mol/L)的舒血管作用。提示NO可能参与低浓度KB-R7943的舒血管作用,KBR7943的血管舒张作用可能与内皮合成并释放NO有关。环氧合酶抑制剂Indo对KB-R7943的舒血管作用没有明显影响,提示PGI2未参与KB-R7943的舒血管作用。

[1]张轩萍,牛栓成,张明升,等.KB-R7943对大鼠离体心脏缺血/再灌注的后适应保护作用[J].中国药理学通报,2008,24(4):522-525.

[2]Poburko D,Liao CH,Lemos VS,et al.Transient receptor potential channel 6-mediated,localized cytosolic[Na+]transients drive Na+/Ca2+exchanger-mediated Ca2+entry in purinergically stimulated aorta smooth muscle cells[J].Circ Res,2007,101:1030-1038.

[3]Santo-Doming o J,Vay L,Hernandez-Sanmiguel E,et al.The plasma membrane Na+/Ca2+exchange inhibitor KB-R7943 is also a potent inhibitor of the mitochondrial Ca2+uniporter[J].Br J Pharmacol,2007,151:647-654.

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[5]Ying S,Xiao ML,Yan M,et al.Na+/Ca2+exchanger inhibitor amellorates impaired endothelium-dependent Na+relaxation induced by high glucose in rat aorta[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Phy siology,2008,35:1265-1270.

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