刘丽星，朱陵群，刘 炜，吴建华，邹忆怀，陈家旭，赵 歆

神经功能的恢复对降低中风病人致残率具有重要意义，围绕恢复的研究主要有两个方面，即再生和重塑。突触后致密物（post sypaptic density，PSD）是由许多动态的蛋白复合体组成并附着于突触后膜，与受体耦合并激动下游信号传递。其中PSD－95为膜相关鸟苷酰基激酶（membrane－associated guanylyl kinase，MAGUK）家族的主要成员，直接作用于门冬氨酸NMDA受体亚单位羧基末端并聚集于突触后膜。突触素（synapto physin，Syp）是第一个被发现的突触囊泡蛋白，在对突出的研究中具有重要作用，是突触的标志性蛋白。三七总皂苷注射制剂（血塞通）已广泛应用于脑梗死患者的临床治疗，并具有一定的临床疗效，但机制尚未明确，本研究探讨其对局灶性脑梗死大鼠模型大脑皮层Syp和PSD－95的蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 药物 注射用血塞通冻干粉购自昆明制药集团股份有限公司，主要成分为三七总皂苷（批号09HA05，400mg／瓶）。尼莫地平片购自拜耳医药有限公司（批号113275，30mg／片）。

1.2 仪器设备与试剂 SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京百事创新科技有限公司。Syp 与PSD－95抗体分别购自Sigma及博奥森公司，二抗购自博奥森公司。日本OLYMPUS BX60型显 微 镜、SPOT－Ⅱ（diagnostic instruments.Inc）软 件、Meta Morph Universal imaging corporation软件。

1.3 模型建立 SD 大鼠40只购自北京维通利华实验动物技术有限公司（雄性300g±20g），许可证编号：SCXK（京）2006－0009。将40只大鼠随机分为非手术组和手术组，手术组采用改良Longa法［1］造模。术前12h禁食，腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉（10mL／kg），暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外近分叉处和颈总动脉近心端，动脉夹暂时夹闭颈总远端，血管剪剪开小口，将尼龙线栓插入颈内动脉中，推进18 mm～22 mm，固定栓线及缝合皮肤。假手术组只进行颈部正中纵行剖开后缝合。术后2h左右清醒，据Longa［2］进行评分，1分～3分者予以纳入。0分：无神经功能缺损表现；1分：对侧前爪无法充分的伸展；2分：向外侧转圈；3分：行走时向对侧倾倒；4分：不能行走，意识丧失。其中1分～3分纳入，0分和4分剔除。

1.4 动物分组及给药方法 纳入符合评分标准的大鼠并随机分为模型组、三七总皂苷大、小剂量组和尼莫地平组，每组8只。按大鼠与人的体表面积等效剂量方法折算出给药剂量为三七总皂苷小剂量为3.6mg／（100g·d）；三七总皂苷大剂量组为7.2 mg／（100g·d），三七总皂苷各组每日腹腔注射；尼莫地平片为1.44mg／（100g·d），灌胃。各组大鼠均于当日手术后5h给药，药物现用现配。

1.5 取材 分别于术后3d、7d、14d、28d用4%多聚甲醛（用pH7.4的0.1mol／L PBS配制）100mL 灌注后取脑，经4%多聚甲醛固定24h，然后进行梯度酒精脱水、包埋，冠状切片（5 μm）并将切片裱于APES处理的载玻片。

1.6 免疫组织化学检测Syp及PSD－95的表达 常规脱蜡石蜡切片并于3%H2O2避光浸泡30min，并置于枸橼酸缓冲液抗原修复后进行3%正常兔血清37 ℃孵育30min，加入一抗（兔抗鼠Syp或兔抗鼠PSD－95），在37℃孵育2h或孵育30min后放入4 ℃冰箱过夜；生物素标记的羊抗兔IgG 37 ℃孵育30 min；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液于37 ℃孵育30 min，用DAB 显色试剂盒显色。空白对照实验：将一抗替换为0.01mol／L PBS，其余步骤相同。在OLYMPUS BX60型显微镜40×10倍数下，随机选取海马梗死区4个视野，采用SPOT－Ⅱ（diagnostic instruments.Inc）软件采集图像，用Meta Morph Universal imaging corporation软件测定阳性光密度值。

1.7 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件分析，录入后常规进行正态性检验、方差齐性检验后进行方差分析。实验数据采用均数±标准差表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三七总皂苷对MCAO 术后大鼠神经症状的影响 模型组神经功能评分在各个时间点上与假手术组相比均显着升高（P＜0.01）。所有手术组在术后5h神经功能缺损严重，评分较高；各组在24h、48h神经功能持续好转。术后72h评分模型组显着高于尼莫地平组和血三七总皂苷各剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。详见表1。

表1 术后各组大鼠神经功能评分比较 分

表1 术后各组大鼠神经功能评分比较 分

与模型组同时间点比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01

组别 n 术后5h 术后24h 术后48h 术后72h假手术组7 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 18 2.00±0.59 1.89±0.58 1.83±0.51 1.78±0.43三七总皂苷大剂量组 18 2.06±0.54 1.83±0.38 1.77±0.42 1.38±0.501）三七总皂苷小剂量组 18 2.11±0.47 1.78±0.55 1.67±0.59 1.33±0.482）尼莫地平组 21 2.05±0.60 1.76±0.44 1.67±0.48 1.28±0.462）

2.2 三七总皂苷对MCAO 术后大鼠皮层PSD－95表达的影响

皮层内PSD－95免疫反应产物呈特异性颗粒状或点状。模型组在MCAO 术后3d、7d 皮层和海马PSD－95表达量低于假手术组（P＜0.01），在14d以后明显增加，28d皮层PSD－95和海马表达量明显高于假手术组（P＜0.01）。在各时间点，不同浓度的三七总皂苷组皮层和海马PSD－95蛋白的表达水平均高于模型 组 （P ＜0.01）；不 同 浓 度 的 三 七 总 皂 苷 组 在MCAO术后28d皮层PSD表达量均高于假手术组和模型组（P＜0.01）。详见表2。

表2 三七总皂苷对缺血性脑梗死大鼠皮层PSD－95蛋白表达的影响

表2 三七总皂苷对缺血性脑梗死大鼠皮层PSD－95蛋白表达的影响

与假手术组同时间点比较，1）P＜0.01；与模型组同时间点比较，2）P＜0.01

组别 n 术后3d 术后7d 术后14d 术后28d假手术组 8 0.205±0.014 0.207±0.018 0.202±0.011 0.203±0.029模型组 8 0.150±0.0141） 0.125±0.0221） 0.172±0.0161） 0.233±0.0121）三七总皂苷大剂量组 8 0.171±0.0172） 0.160±0.0132） 0.195±0.0112） 0.252±0.0142）三七总皂苷小剂量组 8 0.163±0.0172） 0.157±0.0132） 0.181±0.0122） 0.244±0.0132）尼莫地平组 8 0.161±0.0122） 0.144±0.0122） 0.173±0.015 0.236±0.0122）

2.3 三七总皂苷对MCAO 术后大鼠皮层Syp表达的影响 皮层内Syp免疫反应产物呈特异性颗粒状或点状。脑缺血损伤后，Syp的表达水平显着降低，随着恢复时间的延长，皮层和海马内的Syp表达逐渐增强。模型组在MCAO 术后3d、7d皮层的Syp表达量低于假手术组（P＜0.01），在14d以后明显增多，28d皮层Syp的表达量明显高于假手术组（P＜0.01）。在各时间点，不同浓度的三七总皂苷组皮层SYP蛋白表达量均高于模型组（P＜0.01）；不同浓度的三七总皂苷组在MCAO 术后14 d、28d皮层Syp表达量均高于假手术组和模型组（P＜0.01）。详见表3。

表3 三七总皂苷对缺血性脑梗死大鼠皮层Syp蛋白表达的影响

表3 三七总皂苷对缺血性脑梗死大鼠皮层Syp蛋白表达的影响

与假手术组同时间点比较，1）P＜0.01；与模型组同时间点比较，2）P＜0.01

组别 n 术后3d 术后7d 术后14d 术后28d假手术组 8 0.215±0.018 0.217±0.015 0.219±0.022 0.213±0.017模型组 8 0.152±0.0221） 0.123±0.0191） 0.193±0.0241） 0.252±0.0141）三七总皂苷大剂量组 8 0.173±0.0242） 0.166±0.0242） 0.231±0.0202） 0.264±0.0132）三七总皂苷大剂量组 8 0.160±0.0232） 0.155±0.0192） 0.225±0.0212） 0.257±0.0102）尼莫地平组 8 0.175±0.0142） 0.160±0.0202） 0.218±0.0172） 0.242±0.0132）

3 讨 论

PSD－95与突触的可塑性及稳定性以及外周神经的损伤后修复具有重要的关系，影响损伤后突触结构可塑性并对谷氨酸受体有重要的调节作用［3－5］。Syp是参与囊泡运输和胞膜连接的相关蛋白质家族的一员，可间接反映突触的数量、分布和密度，同时参与神经递质的释放［6］，用来研究神经元的发育情况具有特殊研究价值［7，8］。在本实验中发现，各手术组PSD－95在术后在3d及7d时，其含量均低于假手术组（P＜0.01），直到14 d，模型组PSD－95含量仍低于假手术组或近似持平，但药物组PSD－95表达均比模型组高（P＜0.01），说明损伤后大量神经元坏死，虽然神经重塑持续存在，但仍无法达到损伤前水平，而药物在促进突触再生的过程中起着积极的作用；在第28天时各手术组PSD－95含量均高于假手术组（P＜0.01）。在术后3d、7d时，模型组Syn的表达低于假手术组（P＜0.01），而药物组Syn表达量高于模型组（P＜0.01），说明脑梗死后突触数量会迅速减少，而且影响突触的再生，而三七总皂苷和尼莫地平可以有效的促进突触的重塑；手术组各组随时间变化均呈现上升趋势，在14d和28d药物组的Syn的表达量超过假手术组，显示突触含量的再生。研究结果提示血塞通及尼莫地平可能对脑梗死后突触的重建、重塑过程有促进作用，可以改善大鼠局灶性脑缺血后的神经症状，对神经功能重塑有积极作用。

局灶性脑梗死隶属于中医学中的中风病范畴。急性期治疗以祛邪为主，同时注意顾护正气。在中风病治法方面，以活血化瘀、活血通络、益气活血、清化痰热、解毒通络等为主的治疗思想已得到广泛的认同和应用。三七活血化瘀而不损伤正气。三七总皂苷注射剂（血塞通）是以三七总皂苷为主要成分的中药制剂，具有活血祛瘀、通脉活络之功效，广泛运用于临床上治疗中风偏瘫脑、瘀血阻络、或脑梗死等脑血管病后遗症，并取得了很好的疗效。本实验以PSD－95 及Syp 的含量作为研究突触再生、中枢神经恢复的标记物进行观察。根据本实验结果，在脑损伤发生后，三七总皂苷可以改善大鼠术后的神经症状，并促进大脑皮层Syp、PSD－95的再生，反映了突触数量的增加，对于神经元的再生和中枢神经功能的重塑有积极的作用，但对于模型组的Syp和PSD－95在观察期内也出现不断升高的现象还需进一步研究。

［1］ 黄希艳，李倩，朱陵群.片仔癀对脑梗死大鼠ZO－1，MMP－9蛋白及mRNA 表达的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2013，11（63）：342－343.

［2］ Jones N.Stroke：Disruption of the nNOS－PSD－95complex is neuroprotective in models of cerebral ischemia［J］.Nat Rev Neurol，2011，7（2）：61.

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［7］ Garringer HJ，Murrell J，Sammeta N，et al.Increased tau phosphorylation and tau truncation，and decreased sypaptophysin levels in mutant BRI（2）／tau transgenic mice［J］.PLoS One，2013，8（2）：e56426.

［8］ Gutiérrez－Fernández M，Rodríguez－Frutos B，Ramos－Cejudo J，et al.Effects of intravenous administration of allogenic bone marrowand adipose tissue－derived mesenchymal stem cells on functional recovery and brain repair markers in experimental ischemic stroke［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4（1）：11.